Introducción

El pato Pekín (Anas platyrhynchos) y el pato criollo (Cairina moschata domestica) son consideradas aves domésticas de interés económico (^{Kear 2005}, ^{Avilez & Camiruaga 2011}). En particular en el pato Pekín se han realizado la caracterización molecular y el estudio genético de sus poblaciones (^{Maak et al. 2000}, ^{Wang et al. 2004}, ^{El-Gendy et al. 2005}, ^{He et al. 2008}, ^{Hsiao et al. 2008}, ^{Fei et al. 2009}. ^{Shi-Yi et al. 2009}, ^{Su & Chen 2009}).

En estudios de genética de poblaciones, la transferibilidad de marcadores moleculares puede resultar una herramienta muy útil para aprovechar la información generada en especies ampliamente estudiadas y aplicarla en parientes cercanos. Esta herramienta puede aplicarse a distintos niveles taxonómicos, desde microorganismos hasta especies vegetales y animales (^{Weng et al. 2007}, ^{Cristancho & Escobar 2008}, ^{Feng et al. 2009}).

Así mismo, los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la biología (^{Avise 1994}, ^{Hillis & Wiens 2000}). Los diferentes tipos de marcadores empleados en estudios poblacionales o estudios evolutivos se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples. Como, por ejemplo, los marcadores de tipo microsatélite (SSR), que son de tipo co-dominante (^{Simpson 1997}), se repiten muchas veces en un locus particular y están distribuidos de manera relativamente uniforme en muchos loci genómicos diferentes (^{Tautz & Renz 1984}, ^{Wiessenbach & Dib 1992}, ^{Weber & Wong 1993}, ^{Golstein et al. 1996}, ^{Provan et al. 1999}, ^{Yan et al. 2008}).

La transferibilidad de marcadores se hace posible debido a que las regiones flanqueantes al microsatélite se mantienen homólogas permitiendo la afinidad de cebadores entre especies cruzadas. Adicionalmente, la transferibilidad también proporciona mayor eficiencia de trabajo, reduciendo costos de insumos y tiempo, lo cual significa mayor oportunidad de investigación en especies nuevas.

En este estudio, presentamos los resultados del estudio de la transferibilidad de marcadores SSR del pato doméstico Pekín A. platyrhynchos al pato criollo peruano C. moschata domestica.

Material y métodos

Se utilizó muestras de ADN genómico obtenido a partir de plumas de patos criollos Cairina moschata domestica originarios de los departamentos de Lambayeque y San Martín, Perú. Se probaron 24 marcadores microsatélites, los cuales fueron escogidos por su exitosa amplificación y en función a su alto Contenido de Información Polimórfica (PIC) en Anas platyrhynchos pato pekín (Tabla 1). Los cebadores directos fueron construidos con una extensión de 19 pb, la cual es complementaria a los fluoróforos 6- FAM (azul), VIC (verde), NED (negro) y PET (rojo).

Las reacciones de PCR se estandarizaron con el kit KAPA Taq PCR, Kapa Biosystems; realizando variaciones a nivel de concentración de MgCl₂, concentración de cebadores y temperatura de hibridación del cebador y de la cola M13. Finalmente, en un volumen de 10 µL, se contuvo 1X buffer de PCR, dNTPs 0.2 mM, MgCl₂ 1.5 - 3.0 mM, cebador 0.03 - 0.4 µM, 0.1 U de Taq Polimerasa y 2 µL de ADN (30 ng/µL).

Los programas de amplificación se realizaron en un termociclador de gradiente y consistieron en una fase de desnaturalización inicial 95 °C por 2 min, seguido de 30 ciclos de fase de desnaturalización a 95 °C por 45 s, luego una etapa de hibridación del cebador que fue de 50 °C - 65 °C por 1 min; la fase de extensión del ADN a 72 °C por 60 s. La fase de extensión final a 72 °C por 10 min y se detiene a 4 °C por tiempo indefinido (^{Innis & Gelfand 1990}, ^{Kainz 2000}). Adicionalmente, algunos cebadores requirieron 10 ciclos adicionales a 53 °C por 45 s para una mejor hibridación de la cola M13 (^{Schuelke 2000}). Los productos amplificados fueron visualizados mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa 2% y posteriormente separados en un analizador genético ABI 3130XL (Applied Biosystems, Foster, CA. USA) mediante electroforesis capilar. La primera verificación de los productos amplificados se hizo mediante el revelado de los geles de agarosa 2%, y posteriormente se corroboró estos resultados con la revisión de electroferogramas, utilizando el software GeneMapper® Software v.4.0. Finalmente, la prueba de Contenido de Información Polimórfica (PIC), se realizó con el software Cervus v3.0.7.

Resultados

De los 24 marcadores SSR evaluados, 18 mostraron una amplificación exitosa evidenciándose tanto en los geles de agarosa como en electroferogramas obtenidos por el ABI 3130XL: APH01, APH07, APH09, APH13, APH15, APH18, APL02, APL11, APT004, APT021, APT025, APT029, AY295, CAUD001, CAUD004, CAUD022, CAUD026 y CMO211. Los 6 marcadores restantes, no mostraron amplificación para C. moschata domestica a pesar de haber realizado múltiples pruebas con variaciones en las concentraciones del cebador, MgCl₂, y la temperatura de hibridación.

La prueba de Contenido de Información Polimórfica (PIC) se realizó con los 18 marcadores exitosamente transferidos a C. moschata domestica. Sólo 7 marcadores mostraron ser altamente informativos, 4 mostraron ser medianamente informativos y 7 poco informativos (Tabla 1). De este último grupo de marcadores, 3 de ellos (APL02, APH15 y CAUD004) resultaron ser de tipo monomórfico. Así mismo, se encontró que el marcador CMO211 mostraba un rango de peso molecular diferente a lo publicado para A. platyrhynchos (221-283 pb) (^{Su et al. 2007}).

Discusión

La alta tasa de transferibilidad de los SSR evaluados, refleja el alto grado de conservación entre las especies estudiadas. En general, a mayor distancia filogenética menor es el éxito de transferibilidad de los marcadores (^{Peakall et al. 1998}). Sin embargo, esta conservación de las regiones flanqueantes al SSR, hace posible considerar al pato pekín como una especie modelo para la transferencia y aplicabilidad de tecnologías en las poblaciones de patos criollos.

Es importante resaltar que, al tratarse de especies y poblaciones diferentes, el valor PIC mostró valores totalmente divergentes a las reportadas para A. platyrhynchos (^{Su et al. 2007}, ^{Cristancho & Escobar 2008}, ^{Wu et al. 2008}, ^{Baratti et al. 2009}); incluso a nivel de peso molecular del microsatélite CMO211, se encontró diferencias a lo reportado anteriormente (Su et al. 2007). El secuenciamiento del SSR ofrecería nuevas directrices para conocer mejor las razones de tal exorbitante cambio entre las dos especies, posiblemente ayudaría a conocer y entender mejor los mecanismos evolutivos y/o de domesticación en estas especies (^{Aranguren-Méndez et al. 2005}). Así mismo, de los SSR evaluados, siete resultaron ser altamente informativos, por lo que se recomiendan para estudios posteriores de caracterización de las poblaciones de patos criollos.

En resumen, los SSR exitosamente transferibles y estandarizados en eficientes protocolos de PCR que se muestran en nuestro trabajo permitirán estudiar las poblaciones de patos criollos evaluando factores como su diversidad genética, estructura genética poblacional, flujo génico, evolución, tasa de endogamia, entre otros aspectos de importancia para la conservación de la especie, así como para los programas de mejoramiento genético de la misma (^{Shafer et al. 2012}, Orozco-Terwengel 2013, ^{Marín et al. 2014}).

Finalmente, recomendamos tomar en consideración los marcadores medianamente informativos ya que, aunque en menor medida, también reflejan la variabilidad genética de población y pueden aportar información valiosa para el análisis. Los marcadores monomórficos, por otro lado, a pesar de ser informativos para las poblaciones de pato pekín, no resultaron útiles para las poblaciones de pato criollo, por lo que no es recomendable su uso.