Introducción

Juntamente con Salvia, Hyptis es uno de los géneros más importante de la familia Lamiaceae, se caracteriza por poseer especies altamente aromáticas y de usos medicinales. En América, se encuentran la mayoría de las especies de Hyptis distribuyéndose desde Norteamérica hasta Argentina, existiendo unas pocas especies en otras regiones tropicales y subtropicales (^{Harley 1988}). Varias especies de Hyptis presentan aceites esenciales y sustancias con compuestos bioactivos, antimicrobiana, antifúngica, citotóxica, antinflamatoria, anti-HIV, anticancerígenas, antioxidantes, neuroprotectora e insecticida (^{Xu et al. 2013}; ^{Ghaffari et al. 2014}). Razón por la cual en diversos países del mundo tienen un amplio uso medicinal como tratamiento de afecciones respiratorias, gastrointestinal, ginecológico, fiebre, dolor de cabeza, trastornos renales y lesiones en la piel (^{Li et al. 2020}). Además, recientes estudios demostraron que de Hyptis se pueden obtener sustancias con un alto potencial terapéutico que pueden tratar patógenos bacterianos o virales como el SARS-CoV2 (^{Mishra et al. 2021}).

Hyptis australis es una hierba perenne de 30-50 cm de alto con hojas pecioladas y pubescentes como sus tallos, sus flores están dispuestas en inflorescencia capítulo (^{Epling 1949}), es uno de los 47 taxones endémicos de Misiones, y se encuentra en peligro crítico de extinción principalmente por la pérdida de hábitat (^{Zanotti et al. 2020}). Crece en sabanas arboladas sobre afloramientos de arenito o sobre arenisca desarrollada en el Paraje Teyú Cuaré y un ejemplar tipo fue recolectado en 1914 por el escritor uruguayo Horacio Quiroga, quien vivió en dicha localidad (^{Keller & Tressens 2016}). Se reproduce sexualmente por medio de semillas (^{Duarte et al. 2019}), pero las especies del género Hyptis también tienen capacidad de propagarse vegetativamente por estacas (Oliveira et al. 2011). Sin embargo, la información existente de esta especie es escasa y existe un alto desconocimiento acerca de su biología reproductiva, que permita facilitar su reproducción con fines de conservación; ya sea por su importancia ecológica, así como para estudiar posibles usos de la especie.

La estrategia global de conservación de diversidad vegetal propone generar mecanismos de propagación para conservar especies en peligro, en este sentido, la propagación vegetativa por estacas es una técnica que puede utilizarse para el rescate y conservación ex situ de plantas amenazadas (^{Acosta Ramos et al. 2010}), sobre todo cuando se presentan problemas con la germinación y conservación de las semillas (^{Foladori Invernizzi et al. 2021}). Sin embargo, para que la utilización de esta técnica sea efectiva, primero se deben generar protocolos, teniendo en cuenta que el enraizamiento de estacas está influenciado por varios factores tales como el tipo y posición de la estaca, el sustrato, la hormona y dosis utilizada (Bezerra Carvalho et al. 2015, ^{Vaca Molina 2015}). El sustrato porque debe brindar soporte, nutrientes, humedad y aireación (^{Olivo & Buduba 2006}), las hormonas, porque regulan el desarrollo y crecimiento de las plantas (^{Chambilla 2018}) y el tipo y posición de estaca por la concentración endógena de hormonas y la estructura anatómica (^{Ruiz García et al. 2005}, ^{Maia et al. 2008}).

Con la finalidad de proporcionar un protocolo de propagación vegetativa de H. australis a modo de contribuir con su conservación, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de rizogénesis adventicia y brotación en estacas apicales y subapicales de H. australis, en diferentes sustratos (arena, perlita y corteza de pino). Además, estudiar el efecto de la adición exógenas de las auxinas ácido naftalenacético y ácido indolbutírico sobre el desarrollo de raíces y brotes.

Material y métodos

El experimento fue llevado a cabo en un invernáculo de polietileno perteneciente a las instalaciones del Laboratorio de Propagación Vegetativa, Domesticación y Conservación de Recursos fitogenéticos de la Facultad de Ciencias Forestales, Universidad Nacional de Misiones en la ciudad de Eldorado (Misiones, Argentina), durante los meses de otoño.

Para la producción de plantas madre se cosecharon semillas de plantas de H. australis que crecen en el paraje Teyú Cuaré (27°16'54"S latitud y 55°35'29"W longitud), ubicado en la provincia de Misiones, estas fueron identificadas por el doctor Héctor Keller y una muestra fue depositada en el herbario CTES de la ciudad de Corrientes (Argentina), voucher H. A. Keller 13275. Posteriormente fueron germinadas en corteza de pino (Fig. 1 A) y al cabo de un mes se trasplantaron las plantas madre en macetas de 2000 cm³, con corteza de pino (Fig. 1 B) y después fueron fertilizadas con fertilizante granulado NPK cada 6 meses y mantenidas en invernáculo de polietileno durante 1 año con riego automático por micro-aspersión, manteniendo una humedad relativa del 80 - 90 % y una temperatura media del 24 - 27 °C.

De las plantas madre se seleccionaron estacas apicales y subapicales de 15 cm de longitud con 3 o 4 nudos, eliminándose la mayor cantidad de hojas, dejando solo un tercio de las dos hojas superiores más el ápice en el caso de las estacas apicales, con las cuales se realizaron 2 experimentos.

Figura 1: Plantas madres obtenidas de semillas. Plántulas de 15 días de edad (A). Plantas de 7 meses de edad. La barra indica 2 cm en (A) y 10 cm en (B). 

Experimento 1: Efecto de los sustratos. - Las estacas apicales y subapicales, inmediatamente después de la cosecha, fueron plantadas de a una por contenedor en bandejas de plásticos con 25 contenedores de 150 cm³, con diferentes sustratos: arena, perlita o corteza de pino y todas suplementadas con fertilizante granulado complejo NPK de liberación lenta en una dosis de 3 g.L^-1.

Experimento 2: Efecto de las auxinas. - Las estacas apicales y subapicales fueron sumergidas por la parte basal, en una solución acuosa de 100 mg.kg ^-1 de ácido naftalenacetico (ANA) y otro en ácido indolbutírico (AIB), ambos durante 30 minutos y posteriormente plantadas de a una por contenedor en bandejas de plásticos con contenedores de 150 cm³, con sustrato de corteza de pino suplementado con fertilizante granulado complejo NPK de liberación lenta en una dosis de 3 g.L^-1. Para el tratamiento testigo las estacas fueron mantenidas en agua destilada por 30 minutos, previo a su colocación en el sustrato.

Las bandejas de ambos experimentos permanecieron durante 30 días dentro de un invernáculo de polietileno, con las características antes mencionadas.

Diseño experimental y análisis estadístico. - Los experimentos fueron desarrollados con un diseño experimental completamente aleatorizado, con una distribución factorial de los tratamientos en un sistema de 2 (estaca apical y subapical) por 3 (sustrato) y por 2 (tipo de auxina), con 5 unidades experimentales distribuidas en 5 repeticiones, totalizando 25 estacas por tratamiento en ambos experimentos. Transcurridos los 30 días se procedió a evaluar el número de estacas con raíces en porcentaje, el número de raíces primarias, la longitud de raíces (cm), número de estacas con brotes en porcentaje, número y longitud de brotes (cm). Las variables de longitud fueron medidas con una regla de graduación hasta el milímetro sobre un papel milimétrico y en el caso de la longitud de raíces se midieron la raíz más pequeña, una intermedia y la más larga por estaca. Los datos fueron transformados siguiendo la metodología Muñoz y Molina (2016), a continuación se realizó la comprobación de normalidad con el test de Shapiro-Wilk modificado y de homocedasticidad por medio de la prueba de Levene, luego fueron sometidos a un análisis de variancia (ANDEVA) y comparados sus medias por medio del test de Tukey con un nivel de confianza de 0.05 utilizando el software INFOSTAT (^{Di Rienzo et al. 2020}).

Resultados

Efecto del sustrato. - Los resultados indicaron diferencias estadísticamente significativas (p = 0.0067) en la variable porcentaje de enraizamiento en los distintos sustratos, pero no así entre los distintos tipos de estacas. La arena manifestó los mejores porcentajes de enraizamiento en las estacas apicales con un 84.00 ± 16.73% de estacas enraizadas, mientras que en la perlita y corteza de pino los mayores porcentajes de enraizamiento se observaron en las estacas subapicales (Tabla 1). Por otro lado, la corteza de pino, fue el sustrato que presentó menor porcentaje de estacas enraizadas, pero en el número de raíces por estacas no manifestó diferencias significativas con el tratamiento con arena. En la variable longitud de raíces se observó diferencias significativas en el tratamiento compuesto por perlita en ambos tipos de estacas, en relación con los otros sustratos. En cuanto a la interacción de los factores sustrato y tipo de estaca, el análisis de variancia no mostró diferencias significativas.

Con respecto a las variables de brotación se observó diferencias significativas en el porcentaje de brotación (p = 0.0019) y longitud de brotes (p = 0.0089) entre los sustratos y tipos de estacas, en tanto que el número de brotes no fue afectado por los distintos tratamientos. Las estacas subapicales fueron las que presentaron mayor capacidad de brotación y longitud de brotes en los diferentes sustratos, pero la arena y la perlita demarcaron los mejores valores (Tabla 2, Fig. 2A-C). Por otro lado al igual que el porcentaje de enraizamiento no hubo interacción entre los sustratos y los tipos de estacas.

Figura 2 Enraizamiento en los diferentes sustratos. Estacas con y sin ápice en el tratamiento arena (A), en perlita (B) y en Corteza de pino (C). La barra negra indica 2 cm. 

Efecto de las auxinas. - En el segundo experimento, se observó que el tipo de auxina utilizada afecta significativamente el porcentaje de enraizamiento (p = 0.0001) en ambos tipos de estacas, sin embargo, no se manifestó interacción (p = 0.3910) entre los factores estudiados. Por otro lado, el número y longitud de raíces tienen una tendencia a disminuir en las estacas subapicales. Los mejores resultados se presentaron en los tratamientos donde las estacas fueron tratadas con ANA con diferencias altamente significativas sobre los demás tratamientos en el porcentaje de enraizamiento, en tanto que la longitud de raíces no hubo diferencias estadísticas (Tabla 3 Fig. 3A). Contrariamente las estacas del tratamiento con AIB (Fig. 3B) manifestaron los menores valores conjuntamente con las del tratamiento de corteza de pino.

El porcentaje de brotación en el análisis de variancia mostró diferencias significativas en cuanto al tipo de auxina (p = 0.0001) y estaca (p = 0.0017) utilizada, asimismo se observó que la interacción (p = 0.0068) entre las auxinas y el tipo de estacas afectó de manera significativa sobre el porcentaje de brotación, pero las estacas subapicales desarrollaron mayor número y longitud de brotes, aunque sin diferencias significativas con las estacas apicales. Por otro lado, cuando las estacas subapicales fueron tratadas con ANA hubo una mayor cantidad de estacas con brotes con una longitud promedio de 3.39±0.52 cm (Tabla 4). Es importante destacar que las estacas durante el periodo de ensayo no manifestaron enfermedades producidas por patógenos, solamente una necrosis de tejidos en la base de la estaca y en algunas hojas del tratamiento con AIB (Fig. 3B).

Figura 3 Enraizamiento de estacas de Hyptis australis. Estacas con y sin ápice en corteza de pino tratadas con ANA (A). Estacas con y sin ápice tratadas con AIB (B). La barra indica 3 cm en (A) y 2 cm en (B). 

Discusión

Efecto del sustrato. - En este estudio al igual que el de ^{Becerra Carvalho et al. (2015}) en H. pectinata se comprobó que el tipo de sustrato tiene un efecto directo sobre el porcentaje de enraizamiento. Asimismo, se observó que uno de los sustratos que facilita la propagación vegetativa de estacas de H. australis fue la arena, efecto que también fue observado por ^{Da Silva et al. (2012}) en estacas de posición media de Hyptis suaveolens (L.). La arena es un sustrato ampliamente utilizado en la propagación vegetativa de plantas (^{Maia et al. 2008}, ^{Mendes Costa et al. 2015}), principalmente por ser económico y de fácil disponibilidad (^{Soudre et al. 2011}), pero además presenta alta densidad, drenaje rápido, baja porosidad y resistencia, lo que facilita el crecimiento de las raíces, por lo tanto es altamente recomendable en la propagación vegetativas de muchas especies (^{López Acosta et al. 2008}, ^{Francisco et al. 2015}, ^{Goñas et al. 2018}).

^{Aguiar et al. (2017}), en cambio no encontraron diferencias significativas sobre el porcentaje de enraizamiento entre la arena y los demás sustratos analizados en estacas de Rosmarinus officinalis L., siendo indiferente la inducción de raíces adventicias en los diferentes sustratos. Por lo tanto, para que un sustrato sea considerado de buena calidad se debe tener en cuenta tanto las características del mismo, como de las especie que se desea propagar (^{Gerding et al. 1996}).

Otro sustrato que demarcó buenos resultados en las variables de enraizamiento fue la perlita, el cual pudo deberse a las características del sustrato como porosidad, capacidad de drenaje y almacenamiento de agua, que facilitan el desarrollo de raíces (^{Burgos 2004}, ^{Anicua Sánchez et al. 2009}). Por otro lado, la corteza de pino fue el sustrato con menor productividad de estacas enraizadas, efecto manifestado tal vez por sus propiedades físicas e hidrofísicas que lo caracterizan como uno de los materiales orgánico menos apropiados como sustrato, a pesar de presentar un pH ácido y ser fácilmente disponible porque provienen de desechos de la industria forestal. La alta porosidad que posee genera que el agua disponible para la planta esté presente en bajas proporciones, requiriendo de riegos frecuentes para evitar la deshidratación de la planta (^{Zapata et al. 2005}, ^{Sánchez Córdova et al. 2008}). Sin embargo, a pesar de los bajos porcentajes de enraizamiento en el sustrato corteza de pino, el número y longitud de raíces no mostraron diferencias significativas con el sustrato arena. La perlita en cambio fue el sustrato que indujo menor cantidad de raíces, pero de mayor longitud, lo cual podría haber sido ocasionado por la pérdida o lixiviación del fertilizante, ya que sustratos con baja disponibilidad de nutrientes afectan la longitud de las raíces (^{Da Silva et al. 2012}).

El tipo de sustrato también afectó el desarrollo de brotes en las estacas, manifestándose los valores más sobresalientes en los sustratos perlita y arena en el porcentaje de brotación y longitud de brotes, mientras el número de brotes no fue influenciado por el tipo de sustrato. La variable brotación en las estacas es de suma importancia en la propagación asexual de especies vegetales porque el desarrollo de hojas genera una mayor producción de fotoasimilados y síntesis de auxinas, fundamentales para el crecimiento y desarrollo de las raíces adventicias y de la planta en general (^{Becerra Carvalho et al. 2015}).

La brotación de estacas es influenciada por el tipo de sustrato y la posición de estas en la planta madre (^{Becerra Carvalho et al. 2015}), efecto comprobado en este estudio. En contraste las variables de enraizamiento no tuvieron una incidencia positiva correlacionada con la posición de la estaca.

Otros autores sin embargo indicaron que el tipo de estaca en especies del género Hyptis tienen una influencia positiva sobre el enraizamiento (^{Maia et al. 2008}). En este sentido estacas de posición media de Hyptis pectinata y Hyptis suaveolens mostraron diferencias significativas respecto de las apicales y basales en el porcentaje de enraizamiento (Maia et al. 2008, ^{Becerra Carvalho et al. 2015}). En cambio, ^{De Lima et al. (2006}) y ^{Fachinello, (2005}), determinaron que las estacas apicales están más predispuesta al desarrollo de raíces adventicias que las estacas con mayor grado de lignificación. Sin embargo, las estacas apicales, presentan mayor mortalidad por deshidratación, atribuido a su menor grado de lignificación, a pesar de temer condiciones fisiológicas más apropiadas.

Efecto de las auxinas. - Los resultados de este estudio mostraron que el tipo de hormona influye significativamente sobre el desarrollo de raíces y brotes de las estacas de H. australis. Si bien la hormona sintética más utilizadas en la inducción de raíces adventicias es la auxina AIB, porque es más estable en el tiempo, no es tóxica aún en altas concentraciones y es más efectiva en numerosas especies (^{Hartmann et al. 2014}). Sin embargo, los resultados del presente estudio demostraron que el ANA fue la hormona que afectó positivamente el desarrollo de raíces y brotes en estacas de H. australis cuando se utiliza como sustrato la corteza de pino.

Por otro lado, las estacas tratadas con AIB manifestaron los más bajos porcentajes de enraizamiento y brotación incluso que el testigo, convirtiéndose en el tratamiento menos efectivo para inducir raíces adventicias en estacas H. australis en las condiciones estudiadas. Esto, podría relacionarse con el hecho de que el AIB puede tener un efecto tóxico en estacas herbáceas (^{Hartmann et al. 2014}). Contrario a estos resultados, Oliveira et al. (2011), observaron que en las estacas apicales y subapicales de H. leucocephala y estacas basales de H. platanifolia la dosis más alta de AIB (4000 mg.L^-1), fue la que presentó los mejores porcentajes de enraizamiento y concluyeron que el uso de concentraciones de 2000 a 4000 mg.L^-1 de AIB son apropiadas para la propagación vegetativa de esas especies. ^{De Bona et al. (2012}) en cambio determinaron que la adicción de diferentes dosis AIB no generó diferencias significativas en el desarrollo de raíces adventicias en estacas de Lavandula angustifolia con respecto al tratamiento testigo. En consecuencia, la adición exógena de auxinas para inducir rizogénesis adventicias tendría respuestas variables que serían dependientes de la especie, genotipo, sustrato, tipo de estaca y de las concentraciones endógenas de las hormonas de estas plantas (Oliveira et al. 2011, de Bona et al. 2012, Hartmann et al. 2014, ^{Becerra Carvalho et al. 2015}).

Por otra parte, la brotación demarcó una correlación significativa entre el tipo de hormona y el tipo de estaca, siendo las subapicales la más influenciada por la adición exógena de ANA. La incorporación de auxinas como el AIB y el ANA influyen notablemente sobre desarrollo de brotes y esta inducción es afectada directamente por el tipo y posición de la estaca utilizada (^{Boschini Figueroa & Rodríguez 2002}, ^{Ramírez Villalobos & Urdaneta Fernández 2017}).

Conclusión

Hyptis australis es una especie que enraíza sin necesidad de la adición exógena de auxinas, pero esta capacidad puede ser alterada por el tipo de sustrato, independientemente del tipo de estaca que se utilice. El ácido naftalenacetico es una hormona efectiva para inducir raíces y brotes, de H. australis en sustratos que inhiben la rizogénesis adventicia como la corteza de pino.