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INTRODUCCIÓN
El dengue es la arbovirosis de mayor morbilidad y mortalidad en áreas tropicales y subtropicales del planeta, sobre todo en las zonas urbanas y semiurbanas 1. En Perú, hasta el 2022, 20 departamentos presentan hiperendemicidad a dengue principalmente por el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) del genotipo Americano/Asiático 2 y genotipo Cosmopolita asociado a los últimos brotes en Puno, Cuzco y Madre de Dios 3. La detección de anticuerpos del tipo IgG son importantes para la confirmación de casos sospechosos a dengue y estudios de prevalencia siendo las pruebas de ELISA las más usadas por su elevada sensibilidad; sin embargo, la baja especificidad debido a las reacciones cruzadas entre los cuatro serotipos del virus dengue (DENV) y los miembros de la familia Flaviviridae puede generar sesgos en sus resultados 4,5, por lo cual se requiere la confirmación de las muestras positivas con otras pruebas con mejores niveles de especificidad como la prueba de neutralización por reducción de placas (PRNT) considerada la prueba de oro para la detección de anticuerpos neutralizantes y es utilizada para validar otras pruebas de detección de anticuerpos como las pruebas de ELISA y las pruebas cromatográficas, se usa también para determinar la seroconversión de anticuerpos post vacunación y en estudios epidemiológicos permite la discriminación de muestras falsas positivas que pueden aparecer si se utilizan en el tamizaje inicial pruebas altamente sensibles pero con baja especificidad; sin embargo, la prueba de PRNT es una prueba laboriosa, costosa y difícil de ejecutar, lo cual dificulta su utilización 6-8. Por este motivo es necesario desarrollar pruebas en micrométodos como la microneutralización (MNT), la cual utiliza el mismo principio inmunológico que el PRNT, presenta elevada sensibilidad y especificidad permitiendo procesar un mayor número de muestras séricas con ahorro de materiales 9. La MNT ha sido utilizada para la detección de anticuerpos contra los virus Rocio, Ilheus, Zika y otros 10,11, sin embargo su uso en la detección de anticuerpos contra DENV ha presentado dificultades debido a la baja producción de efecto citopático (ECP) de las cepas de DENV en las líneas celulares siendo necesaria una evaluación meticulosa de la técnica para su utilización. Por lo cual el objetivo del presente estudio fue optimizar la prueba de microneutralización para la detección de anticuerpos neutralizantes contra DENV-2.
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se desarrolló en el laboratorio de Virología clínica y molecular de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. La cepa de DENV-2 corresponde a un aislamiento peruano del año 2015. La cepa del virus de fiebre amarilla (YFV) corresponde a una cepa vacunal de STAMARIL (lote: k5338). Las células Vero76 y las muestras de suero fueron obtenidas del laboratorio de Virología clínica y molecular de la UNMSM, siendo este estudio aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación del Instituto de Medicina Tropical "Daniel Alcides Carrión" de UNMSM (Constancia de aprobación CIEI-2021-17).
Producción de la semilla viral DENV-2 y evaluación de la pureza viral
Se inoculó 200 µL de la cepa de DENV-2 diluido 1:10 en un frasco de 25 cm2 con monocapa confluente de células Vero-76, se incubó por 60 min a 37 °C y se adicionó 8 mL de medio de mantenimiento al 2% de suero bovino fetal (SBF), se incubó 9 días para la aparición de ECP, se centrifugó el sobrenadante y se almacenó a - 80 °C. Para evaluar la pureza de la semilla se realizó un ensayo de RT-PCR múltiplex en tiempo real. La extracción del ARN se realizó usando el kit QIAmp viral RNA (Qiagen), siguiendo las indicaciones de fabricante 12. Para el ensayo de RT-PCR en tiempo real se utilizó el kit Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit (Qiagen), y el set de cebadores y sondas de hidrólisis TaqMan descritos por Johnson et al., 2005 13. Se empleó el termociclador Rotor-Gene Q para llevar a cabo el ensayo bajo los siguientes parámetros: Transcripción reversa a 50°C por 15 min, un paso de activación a 95°C por 15 min; 45 ciclos de desnaturación a 95°C por 15 seg hibridación/extensión a 60° por 15 seg.
Producción de la semilla viral YFV
Se inoculó 200 µL de la cepa vacunal de YFV diluido 1:10 en un frasco de 25 cm2 con monocapa confluente de células Vero-76, se incubó por 60 min a 37 °C y se adicionó 8 mL de medio de mantenimiento al 2 % de SBF, se incubó 4 días para la aparición de ECP, se centrifugó el sobrenadante y se almacenó a - 80 °C.
Adaptación de la semilla viral a la línea celular Vero-76
Se propagó la semilla viral inoculando 200 µL del DENV-2 en la dilución 1:25 en frascos de cultivo de 25 cm2 con monocapa confluente de células Vero-76. Se incubó a 37°C por 1 h. Se adicionó 8 mL del medio de mantenimiento al 2 % SBF y se incubó hasta la manifestación ECP de 3+. Se centrifugó la suspensión viral a 2000 rpm/10 min y el sobrenadante se preservó a -80°C. Este proceso se realizó 5 veces.
Titulación viral por plaqueo y PRNT70 para DENV-2
El método empleado se basó en el método desarrollado por Alvarez et al., 2010 (14). Para determinar el título viral, se preparó 3 placas de 24 pozos con una suspensión de células de Vero-76 a una concentración de 2.5 x 105 cel/mL. Se inoculó 50 µL/pozo/triplicado de cada dilución (10-1 a 10-7) de DENV-2. Después de 4 horas, se adicionó medio de recubrimiento con 6 % de carboximetilcelulosa (CMC), se incubó a 37°C y se coloreó los días 7, 8 y 9 días con azul negro de naftol. Una vez determinado el día óptimo de coloración se realizó la PRNT70 para DENV-2, se inactivó todos los sueros a 56°C x 30 min para los respectivos estudios. Los sueros negativos a anticuerpos para DENV-2 fueron evaluados en las diluciones finales de 1:5; 1:10 y 1:20. Los sueros positivos a anticuerpos para DENV-2 se evaluaron en diluciones finales de 1:160; 1:320 y 1:640. La mezcla DENV-2 y suero de anticuerpos se incubó a 37oC por 1h, se inoculó 50 µL/pozo/ duplicado de la mezcla en una suspensión celular de 2.5x105 cel/ mL, se incubó por 4 horas y se adicionó 500 µL/pozo de medio de recubrimiento, se incubó a 37oC y se coloreó la placa al octavo día.
Titulación viral por plaqueo y PRNT70 para YFV
Se inoculó 50ul/pozo/triplicado de las diluciones (10-1 a 10-7) de la cepa vacuna en una monocapa confluente de células Vero-76 en placa de 24 pozos, se adicionó medio de recubrimiento al 3 % CMC, se incubó a 37°C hasta el sexto día de tinción. Para seleccionar muestras positivas y negativas a anticuerpos a YFV mediante la PRNT, se realizó la mezcla YFV- suero en la dilución de 1:5 y se incubó a 37oC por 1h, se inoculó 50 µL/pozo/duplicado de la mezcla incubada en placas de 24 pozos con monocapa completa de células Vero-76, se incubó por 3 horas, se adicionó 500 µL/pozo de medio de recubrimiento con 3 % CMC y se coloreó al sexto día la placa 15.
Optimización de la MNT para DENV-2
Para la optimización se evaluó el método de monocapa completa recomendada por Roehrig et al., 2008 8 y el método de suspensión celular en base al método de Juarez, 2009 10 con algunas modificaciones.
Titulación DENV-2 por el método de monocapa completa
Se prepararon 3 placas de 96 pozos, cada placa contenía 3 concentraciones celulares (0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL, 1.2 x 105 cel/mL) de células Vero-76 en medio de crecimiento al 10 % SBF dispensado en 100 µL/pozo/cuadruplicado. Las placas se incubaron a 37°C / 48 h. Seguidamente se infectó con 100 µL de DENV-2 /pozo de la dilución 10-1 hasta 10-7 usando controles de células en cada dilución. Los pozos se colorearon a los días 9, 10 y 11 con Azul negro de naftol. Se determinó el TCID50 (Dosis infectiva del 50 % en cultivo de células) mediante el método de Reed y Muench 16.
Titulación DENV-2 por el método de suspensión celular
Se prepararon 3 placas de 96 pozos con concentraciones celulares de 0.6 x105 cel/mL, 0.9 x105 cel/mL, 1.2 x105 cel/ml diluidos en medio de mantenimiento al 2 % SBF dispensado en 100 µL/pozo/cuadruplicado. Seguidamente se infectó con 100 µL de DENV-2 /pocillo desde la dilución 10-1 hasta 10-7 utilizando controles de células en cada dilución. Se colorearon las células a los 9, 10 y 11 días con azul negro de Naftol. Se determinó el TCID50 y posteriormente, una vez obtenida la concentración celular óptima, se evaluó la prueba de plaqueo usando medio de mantenimiento con 3 % y 4 % SBF. Finalmente se reevaluó el gradode infección de los pozos y se determinó el TCID50 mediante el método de Reed y Muench 16.
MNT para anticuerpos neutralizantes contra DENV-2
Con los sueros evaluados y seleccionados por PRNT se prepararon diluciones finales de suero negativos a anticuerpos para DENV-2 (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160) y suero positivo a anticuerpos a DENV-2 (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640). Se dispensó 100 µL/pozo de la mezcla virus-suero en la placa de 96 pozos según corresponda la dilución del suero y se incubaron a 37°C por 1 hora. La suspensión celular se preparó a una concentración celular de 0.9 x 105 cel/mL (conteniendo 2 % de SBF), luego se adicionó a razón de 100 µL /pozo. Las placas se incubaron hasta el tiempo óptimo de coloreo a 37°C en condiciones herméticas y se coloreó con 70 µL/pozo de azul negro de Naftol. Se usaron pocillos como control de células, control de virus y control TCID50.
RESULTADOS
Evaluación de la pureza viral, producción de la semilla viral
La pureza de la semilla viral fue confirmada mediante la RT- PCR multiplex en tiempo real dando como resultado positivo a DENV-2 y negativo a los otros serotipos de DENV.
Adaptación de la semilla viral DENV-2 en la línea celular Vero-76
Se evaluó la adaptación de la semilla viral para cada pasaje mediante la manifestación de ECP en los cultivos celulares y la formación de placas líticas en la prueba de plaqueo de 24 pozos. En el primer y segundo pasaje se observó un ECP débil sobre el 25 % y 50 % de la monocapa (1+ a 2+ respectivamente), además se observó placas líticas tenues no definidas para DENV-2 (mediante PRNT) y en el quinto pasaje se observó ECP sobre el 75 % o más de la monocapa (3+) y placas líticas definidas.
Prueba de Plaqueo y PRNT para DENV-2 y YFV
Mediante la prueba de plaqueo, el titulo viral de DENV-2 y YFV fueron 1.4 x 106 UFP/mL (Figura 1) y 1.07x107 UFP/mL respectivamente. Por PRNT se seleccionó 10 sueros negativos a DENV-2 (de los cuales 5 sueros fueron negativos a YFV y 5 sueros positivos a YFV en las diluciones 1:5 y 1:10) y 5 sueros positivos a DENV-2.
Prueba de plaqueo y optimización de la MNT para DENV-2
La prueba de plaqueo para DENV-2 por el método con monocapa completa mostró un ECP bajo sin poderse diferenciar las diluciones virales del control de células y por el método de suspensión celular mostró buen ECP y permitió diferenciar las diluciones virales con el control de células. La concentración celular óptima fue 0.9 x 105 cel/mL. La concentración celular de 0.6 x 105 cel/mL mostró monocapa incompleta en el control de células y la concentración celular de 1.2 x 105 cel/mL, mostró monocapa completa en el control de células, pero el efecto citopático de la cepa nativa DENV-2 no fue muy marcado. El medio de mantenimiento con 2 % SBF fue el porcentaje óptimo al evidenciar la formación de monocapa confluente y una buena manifestación del ECP viral comparado con los otros porcentajes de SBF (Figura 2).
Día óptimo de coloración y determinación del TCID50
El décimo día como fue el día óptimo de coloreo, el control de células presentó monocapa completa al 100% de confluencia y el TCID50 fue 10 3,48 TCID50/ mL según el método de Reed and Munch.
Evaluación de los resultados obtenidos mediante PRNT y MNT para DENV-2
La tabla 1 indica los resultados de la optimización de la MNT para DENV-2 y las concentraciones usadas en la prueba.
Tabla 1 Comparación entre la PRNT y MNT para DENV-2
Abreviatura: PRNT: Prueba de Neutralización por Reducción de Placas, MNT: Pruebas de Microneutralización, SBF:.Suero Bovino Fetal
Títulos de anticuerpos neutralizantes contra DENV-2 obtenidos por PRNT y MNT
Los títulos de anticuerpos neutralizantes de las 15 muestras evaluadas se presentan en la tabla 02.
Evaluación de la reacción cruzada entre YFV y DENV-2 en la MNT para DENV-2
Mediante la MNT, los 5 sueros negativos a la presencia de anticuerpos neutralizantes contra DENV-2 y YFV presentaron la monocapa celular sin ECP, no pudiendo diferenciar entre muestras positivas y negativas contra estos virus en las diluciones 1:5 y 1:10; considerandose como indeterminados. Las muestras negativas a DENV-2 y YFV por PRNT son negativas por MNT a partir de la dilución 1:20.
De los 5 sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV mediante PRNT, 3 sueros mostraron reacción cruzada en la dilución 1:20 y 2 sueros mostraron reacción cruzada en 1:10 (se observó una monocapa celular sin ECP) considerando el resultado como una reacción cruzada entre el virus DENV-2 y los anticuerpos del YFV. A partir de la dilución 1:40 no se presentó reacción cruzada entre DENV-2 y YFV por MNT.
Los títulos de anticuerpos neutralizantes obtenidos en las muestras positivas a DENV-2 y YFV por MNT fueron menores en comparación con la PRNT en dos muestras, siendo todas las muestras positivas para la presencia de anticuerpos neutralizantes del tipo IgG en ambas pruebas. Al comparar la correlación de los resultados de la MNT y el PRNT por el coeficiente de correlación de rangos de Spearman se encontró un R = 0,887 y p < 0,05.
DISCUSIÓN
En el presente estudio se realizó 5 pasajes virales y se encontró que en el primer y segundo pasaje de DENV-2 las placas líticas en la prueba de plaqueo no fueron definidas; no obstante, en el quinto pasaje las placas líticas mostraron una mejor
Tabla 2 Evaluación de 5 sueros negativos a DENV-2 y YFV, 5 Sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV y 5 sueros positivos a DENV-2 y YFV; mediante la PRNT y MNT para DENV-2.
Abreviaturas: DENV-2: Virus del Dengue Serotipo 2, YFV: Virus de la Fiebre Amarilla , PRNT: Prueba de Neutralización por Reducción de Placas , MNT: Pruebas de Microneutralización
definición, siendo necesario estos pasajes virales para adaptar el virus a la línea celular Vero. Teniendo en cuenta la alta tasa de mutación de DENV, es aconsejable mantener los stocks de virus con pasajes bajos y en las líneas celulares como la Vero-76 se sugiere propagar hasta 20 pasajes para prevenir mutaciones en las células que pudieran afectar la replicación viral 17. Se encontró que el método óptimo para la MNT fue el método que utiliza células en suspensión a una concentración de 0,9 x 105 cel/mL. Esta concentración de células en conjunto con la adecuada concentración de SBF (2 %) permiten la formación de una monocapa confluente lo suficientemente densa para permitir la manifestación de un buen ECP y la discriminación de los pozos infectados y no infectados mediante la coloración de las células. El SBF tiene factores de crecimiento, hormonas, minerales, lípidos y otros micronutrientes que ayudan a la proliferación y adhesión celular jugando un rol principal en la formación de la monocapa celular 18 y es uno de los componentes más costosos del medio de cultivo. El porcentaje óptimo de SBF encontrado fue 2 % donde se puede se evidenciar la presencia del ECP a diferencia de las concentraciones de 3 % y 4 % donde no se pudo visualizar el ECP del DENV-2. El uso de SBF al 2 % permitió reducir los costos en la MNT 19 y previene el desprendimiento celular en muestras positivas por la neutralización del virus. En este estudio se observó que utilizando una concentración de 0.6 x105 cel/mL la monocapa celular en el control de células no alcanzó un 100 % de confluencia. Esto podría deberse a que en nuestra metodología la propagación y mantenimiento de los cultivos celulares en frascos y placas se realizó en una incubadora sin inyectar CO2. El uso de CO2 en los cultivos celulares permite mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato del medio y estabiliza su pH 20. No obstante, los cultivos celulares producen su propio CO2 y este fue utilizado para mantener el pH del medio de cultivo al emplear frascos y placas selladas. Por otro lado, el medio se utilizó con un pH de 7.1 y estabilizado con buffer HEPES 8 para evitar la alcalinización en un sistema que no utiliza incubadoras con inyección de CO2.
Figura 3: Evaluación de 15 muestras de suero por la prueba de PRNT y MNT para la detección de anticuerpos contra DENV-2.
En un estudio realizado para determinar la presencia de anticuerpos contra los virus Rocío y Ilheus, se usó una concentración de células Vero-76 de 5 x 105 cel/mL en medio de mantenimiento al 3 % de SBF empleando el método de suspensión celular 10, esto posiblemente se deba a que el ECP de estos virus es más fuerte, por lo cual necesita una monocapa más densa lo cual se logra incrementando la concentración de células y de SBF 18. Otro estudio evaluó la presencia de anticuerpos contra DENV-2 mediante MNT se usó una concentración de células Vero a 1 x 104 cel/mL con el método de monocapa completa y se infectó con DENV-2 (cepa de Nueva Guinea) incubando toda la noche a 37°C 21 la cual es una cepa referencial utilizada en diferentes estudios 22,23 y en este estudio utilizamos una cepa nativa de DENV-2 (aislamiento peruano del 2015). Las cepas nativas de DENV pueden presentar un ECP débil debido a que aún no están adaptadas a las líneas celulares
El título viral del DENV-2 para MNT por el método de Reed y Muench fue 10 3,48 TCID50/ mL. En un estudio realizado por Juarez, 2009 describió que el título del virus Rocio e Ilheus por MNT fue 10 5.17 y 10 6.36 TCID50/ mL respectivamente 10. Medina et al., 2012 reportó que el DENV no alcanza títulos tan altos como otros virus para uso en ensayos biológicos 17, lo cual fue corroborado en este estudio. Con respecto a la citotoxicidad de las muestras de sueros, las altas concentraciones de suero podrían desprender la monocapa celular debido a la toxicidad interfiriendo con los resultados de la prueba y pudiendo reportar resultados falsos negativos por MNT 24, para este estudio no se presentó citotoxicidad en las células Vero-76 a partir de la dilución 1:5; cabe señalar que los 15 sueros fueron inactivados a 56°C x 30 min para inactivar el sistema complemento.
Los 5 sueros negativos a DENV-2 y YFV presentaron monocapa completa en la dilución final 1:10 esto podría deberse a que los sueros aportan nutrientes a las células lo cual podría interpretarse como falsos positivos para la MNT. Para evitar este sesgo se sugiere trabajar las muestras a partir de una dilución de 1:40. Los 5 sueros negativos a DENV-2 y positivos a YFV presentaron reacción cruzada en las diluciones 1:10 y 1:20 para DENV-2, debido a los determinantes antigénicos compartidos entre los serotipos del DENV y miembros de la familia Flaviviridae 5.Para evitar la reacción cruzada entre DENV-2 y YFV en sueros de zonas endémicas es necesario trabajar las muestras a partir de la dilución 1:40 para evitar la reacción cruzada de los anticuerpos de YFV y evitar falsos positivos en la detección de DENV-2. El análisis estadístico de la correlación de los títulos obtenidos por PRNT y MNT para DENV-2 fue estadísticamente significativo (p < 0,05), con una correlación considerada como muy buena y directamente proporcional (R = 0,887). La prueba de PRNT es considerada la prueba de oro para la detección de anticuerpo neutralizantes y permite trabajar diluciones más bajas que la MNT. En el 2008, Putnak y colaboradores describieron que la PRNT es más sensible que la MNT para DENV 25. Existen otras técnicas como la MNT-ELISA la cual usa el principio inmunológico de la MNT y el proceso de coloración de células es remplazado por un revelado mediante una prueba de ELISA. Esta técnica no necesita esperar la aparición del ECP reduciendo el tiempo de incubación de las muestras; sin embargo, utiliza reactivos adicionales como el conjugado, el sustrato y anticuerpos monoclonales o policlonales para la realización del inmunoensayo aumentando los costos de la prueba 21,6. La MNT presenta el mismo principio inmunológico que la PRNT y grandes ventajas como el procesamiento de un mayor número de muestras séricas y ahorro de materiales, insumos y tiempo de procesamiento, los cuales reducen los costos de los ensayos, brinda resultados confiables y se convierte en una herramienta útil en los estudios de vigilancia epidemiológica para identificar, medir y analizar problemas de salud que perjudican a la población, tomar decisiones destinadas a promocionar la salud y prevenir enfermedades 26.
Es importante resaltar que los anticuerpos neutralizantes son anticuerpos de alta especificidad que van a neutralizar al virus viable reconociendo los epítopos virales específicos produciéndose la reacción antígeno - anticuerpo In vitro. Ninguna prueba hasta el momento es superior o reemplaza a la PRNT 25; no obstante, la microneutralización tiene ventajas en la reducción de costos de los ensayos, reducción de tiempo de incubación y del procesamiento de la prueba.
