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Revista de la Sociedad Química del Perú

versão impressa ISSN 1810-634X

Rev. Soc. Quím. Perú v.76 n.2 Lima abr./jun. 2010

 

TRABAJOS ORIGINALES

Evaluación preliminar de la actividad coagulante  del veneno de la serpiente peruana  “loro machaco”

Preliminar evaluation of coagulant activity of Bothrops bilineatus peruvian snake venom “loro  machaco”

 

Edith Rodriguez1 , Gladys Cahuana1 , Gustavo A. Sandoval1 , Mirtha Yarleque1 y Armando Yarleque1

1 Laboratorio de Biología Molecular.Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima –Perú

* e-mail: ayarlequec@unmsm.edu.pe


RESUMEN

Bothrops bilineatus es una serpiente arboricola causante de numerosos accidentes humanos en la amazonia peruana. A partir del veneno completo se ha realizado una exploracion de la actividad coagulante empleando plasma citratado y fibrinogeno comercial, asi como diversos sustratos cromogenicos. Para ello, se han realizado ensayos de tiempo de coagulacion con plasma humano citratado y fibrinogeno bovino 5 mg/ml en buffer Tris-HCl 0,05 M pH 7,4, midiendose tambien la actividad amidolitica sobre BApNA y esterasica sobre TAME y BAEE. Adicionalmente, el veneno fue fraccionado en una columna de filtracion molecular de Sephadex G-100 con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 6,0, analizando la actividad enzimatica en cada una de las fracciones. Ademas, se ha obtenido el perfil electroforetico mediante analisis de PAGE-SDS. Como resultado de este estudio se ha determinado que el veneno total de posee una actividad de 0,59 U/mg sobre plasma y 0,17 U/mg sobre fibrinogeno, siendo estos valores 60% menores en comparacion con el veneno ofidico mas coagulante estudiado en el Peru (Lachesis muta ). Asi tambien, las fracciones con actividad coagulante estan asociadas a la actividad amidolitica y esterasica. El perfil cromatografico obtenido corresponde a tres picos proteicos eluidos con valores de Ve/Vo de 1,1, 1,5 y 2,4, mientras que los electroferogramas obtenidos muestran al menos 10 bandas proteicas entre los 15 y 70 kDa.

Palabras clave: Bothrops bilineatus, veneno, coagulacion.  


ABSTRACT

Bothrops bilineatus is a tree snake whose bite causes many accidents in peruvian jungle. Using whole venom, we made an exploration of its coagulant activity using citrated plasma and commercial fibrinogen, as well as different chromogenic substrates. In this way, we assayed coagulation time on human citrated plasma and bovine fibrinogen 5 mg/ml in Tris-HCl buffer 0,05 M pH 7,4, and also amidolitic and esterasic activities on BApNA, TAME y BAEE, respectively. On the other hand, this venom was fractionated in a size exclusion chromatography using Sephadex G-100 in ammonium acetate buffer 0,05 M pH 6,0, measuring coagulant and amidolitic activities on each fraction. Furthermore, we obtained electrophoretic profiles using SDS-PAGEgels.As a result of this study,we found B. bilineatus  venom has activity on plasma (0,59 U/mg) and fibrinogen (0,17 U/mg), being these values 60% lower in compare with the most coagulant venom studied in Peru ( ). Also, fractions obtained with coagulant activity were associated with amidolitic and esterasic activities. Chromatographic profiles showed three main peaks eluted with Ve/Vo of 1,1, 1,5 and 2,4, respectively, while electropherograms obtained, at least 10 protein bands between 15 and 70 kDa.

Key word: Bothrops bilineatus, venom, coagulation.


INTRODUCCIÓN

El estudio de los componentes de venenos de serpientes que afectan el sistema hemostatico no solo implica el conocimiento de sus caracteristicas quimicas y de sus efectos biologicos sino tambien de otras caracteristicas bioquimicas, farmacologicas, fisiologicas e inmunologicas1 . Entre los principales procesos afectados por la accion de estas ponzonas, se encuentra la coagulacion sanguinea, la cual es el resultado de un complicado proceso cuya etapa final es la transformacion del fibrinogeno a fibrina por accion de la trombina2 .

En nuestro pais, se han realizado investigaciones sobre la capacidad coagulante de los venenos ofidicos3.4 , incluyendo diversas especies del genero y el veneno de la serpiente determinandose que este ultimo presente la mayor actividad coagulante tanto sobre plasma humano como sobre fibrinogeno comercial5 . Sin embargo, existen pocos estudios utilizando el veneno de las serpientes arboricolas, los cuales presentan marcadas diferencias en su accion biologica, con respecto a las demas serpientes6 . Dentro de las serpientes arboricolas presentes en el Peru, se encuentra , comunmente llamada “loro machaco”; es una serpiente venenosa cuyo color verde intenso suele ser motivo para confundirla con la boa , especie que no posee veneno y por esta razon los pobladores nativos suelen destruir a esta ultima temiendo recibir una mordedura. Morfologicamente tiene las siguientes caracteristicas: su tamaño varia entre 60 a 80 cm, su cabeza es triangular con pequenas escamas de color verde, las cuales muestran un tramado a manera de puntos oscuros; todo el dorso hasta la cola es de color verde turquesa y el vientre crema con estriaciones transversales7 . Aunque su distribucion es amplia en la selva peruana, se le encuentra con mayor frecuencia en los departamentos de Amazonas, Loreto, San Martin y Junin.

Nuestro interes en el estudio del veneno de tiene como origen el conocimiento de la accion de esta serpiente sobre presas que no solo pueden trepar arboles, como los roedores u otros pequenos mamiferos, sino tambien sobre las aves de las que eventualmente pueden alimentarse, ya que el hecho de que la serpiente venenosa es arboricola indica que las principales proteinas bioactivas de este veneno estarian dirigidas a inmovilizar aves y mamiferos trepadores considerados como sus presas predilectas, las cuales por su movilidad podrian escapar muy facilmente al ataque de estas serpientes a no ser que su veneno produjera un severo e inmediato cuadro de intoxicacion . Por esta razon, el presente trabajo tuvo como objetivo realizar una evaluacion preliminar del veneno de relacionada principalmente con su actividad coagulante sobre sustratos naturales como el plasma y el fibrinogeno, asi como sobre sustratos sinteticos.

PARTE EXPERIMENTAL

Veneno

Se empleo veneno de la serpiente peruana obtenido a partir de ejemplares procedentes de la region de Pucallpa, departamento de Ucayali y mantenidos en cautiverio en el serpentario “Oswaldo Meneses” del Museo de Historia Natural (UNMSM). La extraccion de la ponzoña se realizo por presion manual de las glandulas, siendo este fluido liofilizado y conservado a 4 .C hasta su utilizacion.

Contenido proteico

La cantidad de proteina fue calculada midiendo la absorbancia de luz UV a 280 nm9 en un espectrofotometro Shimadzu UV 120-02. Ademas, se empleo el metodo de Lowry10 modificado en nuestro laboratorio utilizando un fotocolorimetro Spectronic Bausch&Lomb, y empleando albumina serica bovina como proteina estandar.

Actividad coagulante

Se midio la capacidad de coagulacion del veneno crudo sobre el plasma humano citratado, en comparacion con el fibrinogeno bovino comercial. Para ello se extrajo sangre venosa de personas voluntarias, la cual fue mezclada con citrato de sodio al 3,8% y centrifugada por 20 minutos a 1000 rpm, obteniendose la fraccion sobrenadante correspondiente. Para los ensayos se tomaron 0,2 ml de plasma citratado y 0,1 ml de veneno crudo a diversas concentraciones, incubandose las muestras a 37 .C hasta la obtencion del coagulo total y registrandose los tiempos en segundos . Asimismo se probo la actividad del veneno sobre una solucion de fibrinogeno bovino 5 mg/ml. en buffer Tris-HCl 0,05MpH 7,4. Una unidad de actividad (U) se define como la inversa del tiempo de coagulacion en segundos.

Actividad amidolítica

Se determino segun el metodo de Erlanger et al.11 , para lo cual se preparo una mezcla que contenia 2 ml de sustrato BApNA(benzoil arginil -nitroanilida) 9 x 10 M, 0,6 ml de buffer Tris-HCl 0,05MpH 8,1 y 0,1 ml del veneno crudo. Las mezclas fueron incubadas a 37 .C por 10 minutos deteniendose la reaccion con 0,6 ml de acido acetico al 60% para luego medir su absorbancia a 405 nm. Una unidad de actividad(U) es expresada como μmoles de p- nitroanilida liberados por minuto.

Actividad esterásica

Esta actividad fue ensayada siguiendo el metodo de Devi et al.12 utilizando 1 ml del sustrato TAME(tosil arginil etil ester) o BAEE (benzoil arginil etil ester) 2mMy 1,9 ml de bufferTris- HCl 0,05MpH 7,5. La mezcla se incubo por 3 min a 37 .C adicionandose a continuacion 0,1 ml del veneno crudo y registrandose los incrementos de absorbancia a 247 nm hasta 10 minutos. Una unidad de actividad (U) corresponde a la cantidad de μmoles de TAME o BAEE hidrolizados por minuto.

Fraccionamiento cromatográfico

El veneno liofilizado (60 mg) fue resuspendido en solucion buffer acetato de amonio 0,05M pH 6,0, eliminandose los restos insolubles por centrifugacion a 4000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue aplicado a una columna de filtracion molecular de Sephadex G-100 SF (1,5 x 46,5 cm) equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 6,0. La elucion se realizó a temperatura ambiente colectandose fracciones de 2 ml en un colector automatico Pharmacia 121 LKB. La elucion de las proteinas de la columna se realizo con el mismo buffer y se estimó la actividad enzimatica de cada fraccion obtenida sobre BApNA.

Análisis electroforético Se empleo la electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes con SDS (PAGE-SDS)13 . La corrida electroforética se realizo aplicando 100 V constantes durante 1 h. Luego el gel fue tenido con azul brillante de Coomassie 0,1% por 10 min, para luego ser decolorado hasta evidenciar las bandas proteicas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Actividad enzimática del veneno de B. bilineatus

El veneno completo de Bothrops bilineatus fue capaz de coagular el plasma humano citratado y el fibrinogeno bovino, donde se encontraron actividades especificas de 0,59 y 0,17 U/mg, respectivamente (tabla 1). Dicha ponzona tambien mostro capacidad para hidrolizar sustratos sinteticos como el BApNA con una actividad especifica de 0,018 U/mg, mientras que sobre esteres sinteticos de arginina como el TAME y el BAEE mostro una actividad de 1,04 U/mg y 0,85 U/mg, respectivamente.

 

Separación cromatográfica del veneno de B. bilineatus

Empleando una cromatografia en Sephadex G-100 SF (figura 1), el veneno fue fraccionado en tres picos de proteina con valores deVe/Vo correspondientes a 1,1, 1,5 y 2,4, respectivamente. Ademas, se encontro que las fracciones correspondientes al primer pico presentaron actividad enzimatica sobre BApNA.

 

Perfil electroforético

La figura 2 muestra el patron proteico obtenido para el veneno de B.bilineatus mediante PAGE-SDS en condiciones no reductoras empleando geles de poliacrilamida al 10%. Del analisis respectivo se pudieron detectar al menos 10 bandas proteicas, comprendidas en el rango de peso molecular de 14 a 70 kDa. Ademas, el mayor numero de bandas se agrupó alrededor de los 40 kDa.

 

El mecanismo de coagulacion sanguinea es un proceso complicado que tiene como finalidad la conversion del fibrinogeno plasmatico (factor I) en fibrina por accion de una proteasa especifica, la trombina, que hidroliza los enlaces arginil-glicil del fibrinogeno. La molecula del fibrinogeno presenta una estructura trinodular; esta formada por tres pares de cadenas polipeptidicas unidas por puentes disulfuro; tales cadenas son 2Aα, 2Bβ y 2 γ.La propiedad coagulante de la trombina radica en la liberacion de dos pares de pequenos peptidos polares, los fibrinopeptidosAy B de las cadenasA , respectivamente, convirtiendo al resto de la molecula en el monomero de fibrina. Estos monomeros, a su vez, se polimerizan espontaneamente mediante dos diferentes clases de interacciones moleculares, “extremo a extremo” y lateral, para formar el coagulo insoluble de fibrina.

Actividad enzimática del veneno de B. bilineatus sobre diferentes sustratos

En el presente estudio se evaluo la capacidad coagulante del veneno de B.bilineatus utilizando en primer lugar sustratos naturales como el plasma citratado y el fibrinogeno comercial14 . Por un lado la accion coagulante sobre el plasma indica la presencia de compuestos activadores de la cascada de coagulacion sanguinea, los cuales varian tanto en su concentracion, asi como en su actividad y especificidad. Por otro lado, el veneno de pudo coagular el fibrinogeno bovino, indicando que presenta dentro de su composicion al menos una enzima con actividad similar a trombina.

La evaluacion de las propiedades cineticas de enzimas coagulantes presentes en los venenos y que esten relacionados con la coagulacion sanguinea es complicada por dos hechos: 1) la naturaleza del sustrato: una proteina y 2) la especificidad de la enzima. Si bien se puede establecer la naturaleza coagulante de un veneno utilizando sustratos naturales, como el plasma citratado o fibrinogeno bovino, se requiere de sustratos sinteticos que imiten las estructuras involucradas en el enlace peptidico del sustrato original y que faciliten su deteccion en un ensayo . Este tipo de compuestos posee en su extremo carboxilo terminal, un grupo cromogeno como la -nitroanilida, el cual es liberado como parte de la hidrolisis y es detectado espectrofotometricamente a 405 nm.

De los ensayos con sustratos sinteticos, se encontró que el veneno de B. bilineatus presentó actividad amidolitica sobre BApNA y esterasica sobre TAME y BAEE. En el caso del BApNA, este tipo de sustrato permite la caracterizacion de enzimas del grupo de las serinoproteasas como la tripsina y quimiotripsina y al cual pertenecen diversas enzimas coagulantes como las enzimas similares a trombina y los activadores de diversos factores de coagulacion, entre ellos la protrombina y el factor X . Por otro lado, el empleo del TAME y el BAEE, por su estructura molecular, permite la caracterizacion de enzimas que hidrolizan el enlace ester entre la arginina y el grupo metilo. La capacidad del veneno completo para hidrolizar este tipo de sustratos nos indica que estan presentes enzimas que pertenecen al gran grupo de proteasas esterasicas . Este analisis tambien fue realizado utilizando el veneno completo de empleando tanto sustratos naturales como cromogenicos para su caracterizacion4 .

El analisis comparativo de la actividad coagulante de los venenos de B. bilineatus y de Lachesis muta (tabla 1), señala claramente que el primero de ellos solo registra un 40% de la actividad coagulante registrada en su homologa, lo que en apariencia puede significar una pobre accion coagulante del veneno en estudio. Habiendo determinado que el veneno crudo es capaz de coagular el fibrinogeno y el plasma citratado, resulta necesario explorar la existencia de proteinas que participen en esta accion, entre ellas la enzima similar a trombina y algunos de los factores procoagulantes2 . Asi, tenemos que la serpiente arboricola , Agkistrodon acutus llamada vibora de cinco pasos y que habita en el sudeste asiatico, tiene una potente accion cardiotoxica. Del mismo modo, en la selva del noreste y en la region central del Africa habitan las especies arboricolas del genero Dendroaspis, conocidas como “mambas”, las cuales son temidas por su agresividad, velocidad de desplazamiento y por su potente veneno neurotoxico. Por ello, asumimos que el veneno de B. bilineatus podria contener otros principios activos que afectaran directamente el sistema circulatorio produciendo severos desordenes responsables de una rapida y masiva coagulacion y por tanto, de la falta de oxigenacion tisular.

Patrón electroforético del veneno de B. bilineatus

Los venenos de serpientes son consideradas mezclas complejas de diversos componentes proteicos, comprendiendo tanto enzimas como toxinas17 . Una de las tecnicas mas empleadas para su estudio es la electroforesis en geles de poliacrilamida13 , la cual se basa en la migracion de proteinas a traves de un campo electrico. Esta tecnica es util como un metodo analitico, ya que las proteinas pueden ser separadas y visualizadas, sean analizadas en su conformacion nativa como denaturada.

Afin de realizar un analisis inicial de los componentes proteicos del veneno de B. bilineatus, se realizaron electroforesis mediante la tecnica de PAGE-SDS13 (figura 2). Los resultados muestran un patron caracteristico distinto para el contenido proteico de este veneno comparado con otros venenos de serpientes descritos previamente por nuestro laboratorio5 . Se pudieron observar bandas notorias concentradas entre los 20 y 40 kDa, ademas de bandas proteicas alrededor de los 50 y 70 kDa. Estos pesos moleculares indicarian la presencia de compuestos como las miotoxinas (20-25 kDa), hemorraginas (19-20 kDa), proteinas coagulantes (30-40 kDa), asi como L-aminoacido oxidasas (60 kDa). Es claro notar que la diversidad de compuestos proteicos asi como la abundancia y posicion relativa de las bandas electroforeticas permite hacer una clara distincion entre este veneno con otros descritos previamente18 .

CONCLUSIONES

La presente investigacion ha permitido de forma preliminar que el veneno de la serpiente arboricola peruana actua sobre diversos componentes de la cascada de coagulacion, entre ellos el fibrinogeno, activando esta importante via y permitiendo una rapida inmovilizacion de sus presas. Ademas, el veneno de esta serpiente presenta un patron particular de proteinas lo cual permitira su rapida identificacion.

AGRADECIMIENTOS

Los autores del presente trabajo agradecen a la International Foundation for Science (IFS) de Suecia, por su importante y valiosa ayuda financiera para la ejecucion de investigaciones sobre principios coagulantes de venenos de serpientes peruanas.

 

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Recibido el 17-12-2009