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Revista de la Sociedad Química del Perú

Print version ISSN 1810-634X

Rev. Soc. Quím. Perú vol.76 no.2 Lima Apr./jun. 2010

 

TRABAJOS ORIGINALES

Aislamiento y caracterización parcial de una enzima similar atrombina del veneno de la serpiente peruana bothrops atrox “jergón”

isolation and partial characterization of a thrombin-like enzyme from bothrops atrox peruvian snake venom “jergón”

 

Gustavo A. Sandoval1*, Nora Ruiz1, Fanny Lazo1, Edith Rodríguez1, Armando Yarleque1, Russolina B. Zingali2  

1Laboratorio de Biología Molecular. Facultad de Ciencias Biologicas. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima – Peru

2Laboratorio de Hemostasia y Venenos. Departamento de Bioquimica Medica. Universidad Federal de Rio de Janeiro. Rio de Janeiro - Brasil.

*E-mail: gsandoval@peru.com


RESUMEN

Se ha determinado algunas propiedades bioquímicas de la enzima similar a trombina (EST) de la serpiente peruana “jergón”. Para este fin, la enzima fue purificada utilizando tres pasos cromatrográficos: Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB. Asimismo, se determino el peso molecular por PAGE-SDS y el porcentaje de carbohidratos asociados mediante hidrolisis y análisis de hexosas, hexosaminas y acido siálico. Se ensayaron las actividades fibrinocoagulante, amidolìtica y esterásica, sobre fibrinógeno bovino, BApNA y BAEE, respectivamente. Como resultado del análisis se determino que la enzima constituye el 1,7% del veneno completo, siendo purificada 25,5 veces y con un rendimiento del 43,3% utilizando BApNA como sustrato. La enzima presenta un peso molecular de 29,6 kDa, del cual el 14,2% lo constituyen los carbohidratos asociados. La EST de B. atrox produjo coagulación del fibrinógeno bovino y presento actividad sobre BAEE y BApNA. De esta manera se ha logrado purificar y caracterizar al principal componente del veneno de B. atrox relacionado con su actividad coagulante.

Palabras clave: Bothrops atrox, enzima similar a trombina, veneno, coagulación.  


ABSTRACT

We have determined some biochemical properties of a thrombin-like enzyme (TLE) isolated from Bothrops atroxperuvian snake venom “jergon”. In this concern, TLE was purified until homogeneity using three chromatographical steps: on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Furthermore, molecular weight was determinate by PAGE-SDS and associated carbohydrates by hydrolysis and analysis of hexoses, hexosamines and sialic acid. Then, fibrinocoagulant, amidolytic and sterasic activities were measured on bovine fibrinogen, BApNAand BAEE, respectively.As a result of these analyses, we determined that this enzyme represents 1,7% of total venom and was 25,5-fold purified with a 43,3% yield,using BApNA as substrate. This enzyme had 29,6 kDa, where 14,2% was associated carbohydrates. The TLE of B. atrox produced coagulation of bovine fibrinogen and had enzymatic activity on BAEE and BApNA. In conclusion, we have purified and characterized the main component of B. atrox venom related to its coagulant activity.

Key words: Bothrops atrox, thrombin-like enzyme, venom, coagulation.


INTRODUCCION

Las serpientes del genero habitan una extensa región de América y en el Perú presenta hasta 17 especies, siendo Bothrops atrox “jergon” la mas abundante y peligrosa, porser causante del 90% de los accidentes ofidicos en el país1,2 . Como consecuencia de la mordedura se presenta, dolor intenso en la zona afectada, edema, hemorragia y un severo descenso de la presión arterial que ocasiona la muerte; en otros casos una masiva necrosis que lleva a la amputación del miembro afectado3.

En estudios previos realizados con el veneno de esta serpiente, se ha determinado que posee una accion marcada sobre la coagulación sanguínea4,5 , determinandose las siguientes actividades: esterasica, fibrinolitica y kininogenasica, las cuales se encuentran relacionadas con esta acción biológica. Dentro de los componentes enzimaticos relacionados con este fenomeno se encuentran principalmente las enzimas similares a trombina (ESTs) las cuales producen coagulos que bloquean parcialmente la circulación sanguínea, la cual ha sido detectada en varios venenos botropicos, incluido , B. atrox, utilizando como sustratos tanto plasma bovino como fibrinogeno bovino y canino6 . Cuando estos compuestos son aplicados en animales o humanos, producen un descenso en los niveles de fibrinogeno resultando en un estado benigno de hipofibrinogenemia, razon por la cual es empleada en el campo clinico parael tratamiento de oclusiones vasculares y terapias defibrinogenantes7 . Por esta razon se hace necesario continuar y profundizar los estudios bioquimicos de los principios activos de venenos de las especies de serpientes peruanas.

En este contexto, en el presente trabajo se describe la purificacion de la enzima similar a trombina del veneno de B. atrox mediante técnicas cromatograficas, asi como su caracterización bioquímica parcial.

PARTE EXPERIMENTAL

Material biológico

Se utilizo el veneno de ejemplares adultos de Bothrops atrox procedentes de Pucallpa (Ucayali) y mantenidos en cautiverio en el serpentario “Oswaldo Meneses” del Museo de Historia Natural de la UNMSM. El veneno fue extraido por presion manual de las glándulas venenosas, siendo luego liofilizado y conservado a 4 °C hasta su utilizacion en las pruebas experimentales correspondientes.

Cuantificación de proteínas

La cantidad de proteina fue calculada midiendo la absorbancia de luz UV a 280 nm8 en un espectrofotometro Shimadzu UV 120-02. Ademas, se empleo el metodo de Lowry9 modificado en nuestro laboratorio4 , utilizando un fotocolorimetro Spectronic Bausch & Lomb, empleando albumina serica bovina como proteina estandar.

Purificación de la enzima similar a trombina

La metodologia de purificacion utilizada se baso en el procedimiento reportado previamente para el aislamiento de la EST de Lachesis muta. Como primer paso, se aplicaron 200 mg de veneno crudo disueltos en 2mLde buffer acetato de amonio 0,05 M, pH 6,0 a una columna de Sephadex G-75 (1,2 x 45,2 cm). La muestra fue eluida con el mismo buffer a un flujo de 13mL por hora, colectandose fracciones de 1 mL en un colector automatico de fracciones Pharmacia-LKB. Las fracciones con mayor actividad sobre BApNA fueron juntadas, concentradas y aplicadas a una segunda columna de CM Sephadex C-50 (1,2 x 35 cm),usandose como eluente buffer acetato de amonio 0,05 M, pH 6,0. Las fracciones retenidas en el sistema cromatografico fueron eluidas utilizando el mismo buffer conteniendo NaCl 0,4 M.

Luego, las fracciones con mayor actividad amidolitica fueron juntadas, dializadas contra agua destilada y liofilizadas. Para el tercer paso cromatografico, las fracciones anteriores, resuspendidas previamente en bufferTris-HCl 0,05 M, NaCl 0,5 M, pH 7,5, fueron aplicadas a una columna de agarosa-PAB (0,8 x 6,0 cm). Las fracciones retenidas por afinidad fueron eluidas empleando buffer Tris-HCl 1 mM, NaCl 0,5 M, pH 3,0 y neutralizadas usando Tris 1M. Finalmente, las fracciones con mayor actividad sobreBApNAfueron concentradas y mantenidas en congelacion para su posterior caracterizacion.

Actividades enzimáticas

Actividad fibrinocoagulante

Esta actividad se evaluo por el tiempo de formacion del coagulo originado por la accion de la enzima sobre el fibrinogeno bovino11 . Una unidad de actividad (U) se define como la inversa del tiempo de coagulacion en segundos.

Actividad amidolítica

Fue determinada empleando BApNA como sustrato, midiendose la liberacion de -nitroanilida a 405 nm12 . Una unidad de actividad (U) es expresada como μmoles de -nitroanilida liberados por minuto.

Actividad esterásica

Se determino midiendo la hidrolisis del sustrato BAEE y registrandose la absorbancia a 253nm13 . Una unidad de actividad (U) corresponde a la cantidad de μmoles de BAEE hidrolizados por minuto.

Evaluación de la pureza y determinación del peso molecular

Se empleo la electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes con SDS14 (PAGE-SDS) , en un equipo Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad Laboratories). La corrida electroforetica se realizo aplicando 100 V constantes durante 1 h. Luego el gel fue tenido con azul brillante de Coomassie 0,1% por 10 min, para luego ser decolorado hasta evidenciar las bandas proteicas.

Determinación de azúcares asociados

Para la determinacion de carbohidratos asociados se emplearon las tecnicas descritas por Winzler15 para hexosas y hexosaminas, y por Warren16 para acido sialico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Purificación de la enzima y estimación del peso molecular

En el primer paso de purificacion en Sephadex G-75 (figura 1A), el veneno fue fraccionado en tres picos de proteina, encontrandose la actividad enzimatica en las fracciones correspondientes al primer pico con un Ve/Vo de 1,50. La actividad amidolitica estuvo presente en estas fracciones, las cuales, despues de ser juntadas y concentradas, fueronpasadas a traves de una columna de CM Sephadex C-50. En el segundo paso de purificación (figura1B) la actividad amidolitica fue ubicada en las fracciones que se separaron de la matriz empleando NaCl 0,4 M, y en el tercer paso de purificacion (figura 1C) usando una columna de agarosa-PAB se consiguio la separacion completa de la enzima luego de aplicar buffer Tris-HCl 1 mM, NaCl 0,5 M, pH 3,0. Se logro una purificacion de 25,5 veces, un rendimiento de 43,3% y 1,7% de proteina activa recuperada (tabla 1). El ensayo electroforetico en PAGESDS mostro que la enzima purificada corresponde a una unica banda homogenea con un peso molecular aproximado de 29,6 kDa (figura 2).

 

(A) Fraccionamiento del veneno crudo en Sephadex G-75 empleando buffer acetato de amoniopH6,0.

(B) Separacion de las fracciones previas en una columna deCMSephadex C-50. Las fracciones eluidas con NaCl 0,4Mfueron desaladas, concentradas y aplicadas a un tercer paso cromatografico.

(C) Cromatografia en agarosa-PAB. Las fracciones se separaron empleando buffer Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,5 M, pH 7,5. Las fracciones retenidas fueron eluidas empleando buffer Tris-HCl 1 mM, NaCl 0,5 M, pH 3,0. La linea continua (-----)indica la absorbancia a 280 nm, mientras que la linea punteada (- - -) la actividad especifica sobre BApNA en de -nitroanilina liberados por minuto y por mg de proteina.

 

Actividad sobre diferentes sustratos

La enzima similar a trombina purificada fue capaz de coagular el fibrinogeno bovino; comparando los tiempos de coagulacion obtenidos con el veneno crudo y la enzima purificada se encontraron actividades especificas de 1,26 y 5,50 U/mg de proteina, respectivamente, siendo la actividad de la enzima purificada 4,37 veces mas que la actividad del veneno crudo (tabla 2). La enzima purificada tambien muestra una gran capacidad para hidrolizar sustratos sinteticos como el BApNAcon una actividad especifica de 0,874 U/mg de proteina, mientras que sobre esteres sinteticos de arginina como el BAEE, mostro una actividad de 45,83 U/mg de proteina, siendo la actividad purificada 25,5 y 23,4 veces, respectivamente, con respecto a la actividad mostrada por el veneno crudo (tabla 2).

 

 

 

Contenido de carbohidratos

El analisis de carbohidratos para el veneno crudo determino un 1,83% de hexosas, 0,61% de hexosaminas y 0,19% de acido sialico; haciendo un total de 2,63% de carbohidratos asociados. En cambio la enzima purificada registro 12,1% de hexosas, 1,36% de hexosaminas y 0,75% de acido sialico, con un total de 14,21% de carbohidratos, lo que demuestra que se trata de una glicoproteina (tabla 3).

Los venenos de los viperidos presentan cantidades significativas de enzimas similares a trombina y el mecanismo de formacion del coagulo de fibrinogeno por accion de estas es diferente al provocado por trombina. Estos componentes preferentemente liberan solo fibrinopeptidos A o B, mientras que la trombina produce la liberacion de ambos fibrinopeptidos de la molecula del fibrinogeno. La mayor parte de las enzimas similares a trombina son serinoproteasas y no solo son similares a la trombina en sus propiedades fisicas y quimicas sino que contienen residuos reactivos de serina, acido aspartico e histidina, como la trombina. Un hecho importante es que las actividades coagulante y esterasica de estas enzimas son inhibidas simultaneamente por agentes especificos que modifican la proteina, siendo este un indicativo que dichas actividades parecen residir en el mismo sitio activo.

En el presente trabajo se purifico la enzima similar a trombina del veneno de B. atrox utilizando una combinacion de cromatografia en Sephadex G-75, CM Sephadex C-50 y agarosa-PAB. El primer sistema que permitio la separacion del extracto proteico que constituye el veneno se diferencio en tres picos principales de proteina, correspondiendo la enzima al primer pico. Esto nos indica que la proteina coagulante que hemos aislado se encuentra en torno a la fraccion proteica de alto peso molecular que eluye con un volumen de elucion (Ve) cercano al volumen vacio o muerto (Vo). En el segundo paso se logro la separacion de dos picos de proteina eluida con el buffer inicial mientras que la enzima similar a trombina eluye al adicionarse al buffer NaCl 0,4My el hecho de que aparezca en el primer pico indica claramente que se encontraba atrapada por el intercambiador lo que significa que se trata de una proteina cargada positivamente a pH 6,0, es decir, que su pI estaria en el rango de neutro o ligeramente alcalino. Como tercer paso cromatografico (figura 1C) se empleo una columna de agarosa - -aminobenzamidina (PAB). Esta molecula es un inhibidor competitivo especifico de serinoproteasas, mediante la cual se pudo retener a las fracciones con afinidad a esta para su posterior separacion mediante un cambio en el valor de pH de 7,5 a 3,0. Con esta metodologia se consiguio separar la enzima similar a trombina mientras que las fracciones que no se ligaron a la columna correspondian a proteinas contaminantes. Del analisis electroforetico de la fraccion obtenida (figura 2) se demostro la existencia de una sola banda proteica y por tanto podemos afirmar que el metodo desarrollado es apropiado y sencillo para purificar esta enzima logrando un factor de purificacion de 25,5 veces y un rendimiento de 43,3%.

Las enzimas similares a trombina purificadas de otros venenos han sido obtenidas mediante combinaciones de tecnicas cromatograficas. Asi tenemos que para la purificacion de la balterobina, enzima coagulante aislada del veneno de Bothrops alternatus , se emplearon metodos cromatograficos sobre Sephadex G-75, Heparina-Sepharosa y HPLC . Del mismo modo Jin et al. purificaron la enzima jerdonobina-II del veneno de Trimeresurus jerdonii, aplicando la muestra en primer lugar a un intercambiador cationico de CM Sephadex C-25, posteriormente a una columna de filtracion en Sephadex G-100 super fino y finalmente a una columna C8 de HPLC en fase reversa18 . Finalmente, la enzima similar a trombina del veneno de Lachesis muta fue aislada por Yarleque et al., a traves de tres pasos cromatograficos, los dos primeros en Sephadex G-100 y el ultimo en una columna de intercambio ionico de DEAECelulosa, lograndose una purificacion de 28,92 veces y un rendimiento de 44,76% 10. El analisis electroforetico con SDS en condiciones no reductoras (figura 2) demostro que la enzima purificada presenta una sola cadena polipeptidica, con un peso molecular aproximado de 29,6 kDa. Esta enzima tiene un mediano peso molecular pero se encuentra dentro del rango de pesos moleculares reportados para varias enzimas similares a trombina aisladas de venenos de serpientes19 .

La enzima similar a trombina aislada de B. atrox mostro la capacidad de hidrolizar diversos sustratos sinteticos que contienen como grupo cromogenico a la -nitroanilida. Durante los diversos pasos de purificacion se empleo el sustrato BApNA, el cual permite la caracterizacion de enzimas del grupo de las serinoproteasas como la tripsina y quimiotripsina y al cual pertenecen las enzimas similares a trombina de venenos de serpientes . Las fracciones que mostraron mas actividad sobre este sustrato fueron ensayadas en su capacidad para coagular el fibrinogeno bovino obteniendose resultados positivos indicando que ambas actividades estan presentes en la enzima en estudio. En el caso del BAEE, por su estructura molecular permite la caracterizacion de enzimas que hidrolizan el enlace ester entre la arginina y el grupo metilo. La capacidad de la enzima para hidrolizar este sustrato nos indica que esta pertenece al gran grupo de proteasas esterasicas20

Otro de los aspectos que se abarco en esta investigacion fue la asociacion de carbohidratos a la estructura proteica de la enzima similar a trombina purificada. La enzima purificada mostro ser una glicoproteina, conteniendo 12,1% de hexosas, 1,36% de hexosaminas y 0,75% de acido sialico (tabla 3). Estos valores se encuentran dentro del rango reportado para diferentes enzimas similares a trombina aisladas de venenos de serpientes . Un posible rol de los oligosacaridos en las glicoproteinas es el de modular sus propiedades fisicoquimicas, tales como la solubilidad, viscosidad, estabilidad de carga. Respecto a este ultimo punto, al tratar la enzima similar a trombina del Lachesis muta con una N- glicosidasa F (PNGasa F) y proceder a la electroforesis mediante PAGE-SDS, se observo un aumento en la movilidad electroforetica de la proteina tratada en comparacion con la proteina no tratada . Otro rol probable de los carbohidratos seria el de proteger a la enzima de la proteolisis, teniendo en cuenta el entorno fuertemente proteolitico del veneno.

CONCLUSIONES

En el presente trabajo se ha logrado purificar y caracterizar al principal componente del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox relacionado con su actividad coagulante. Las caracteristicas bioquimicas de esta enzima descritas en el presente articulo serviran de base para el estudio de sus propiedades inmunogenicas a fin de desarrollar estrategias para neutralizar su actividad toxica.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue iniciado en el Laboratorio de Biologia Molecular de la UNMSM y finalizado gracias al financiamiento otorgado al Blgo. Gustavo Sandoval por la Red de Macrouniversidades de America Latina y el Caribe a traves de una beca de investigacion en la Universidad Federal de Rio de Janeiro como parte del desarrollo de su tesis de maestria en Biologia Molecular.

 

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Recibido el 17-12-2009