TRABAJOS ORIGINALES

Efecto antiagregante plaquetario in vivo y fibrinolítico in vitro del extracto etanólico de las hojas de Oenothera rosea Aiton (chupasangre)

Antiplatelet effect in vivo and fibrinolytic in vitro ethanol extract leaves Oenothera rosea Aiton (chupasangre)

Hilda Vanessa Díaz Porras^a* ; César Fuertes Ruitón^a ; Delia Whu Whu^b ; Bertha Jurado Teixeira^c ; Mirtha Roque Alcarraz^d ; Jorge Arroyo Acevedo^e

The phytochemical analysis of the ethanol extract of the leaves of Oenothera rosea Aiton were identified: tannins, flavonoids, quinones, alkaloids and saponins, the main objective to determine the effect of ethanol extract of the leaves of Oenothera rosea Aiton on hemostasis, to that was evaluated the in vitro fibrinolytic effect of ethanol extract at the following concentrations: 5.8, 0.29 and 0.014 mg/ml human venous blood to the antiplatelet effect was given 25, 50 and 100 mg/kg of extract 40 female albino rats, which were divided into 5 groups of 8 animals each. The control group was administered saline 5 ml/kg and used aspirin 100 mg/kg, as standard drug, we determined the prothrombin time and clotting time obtaining greater effect than 50 mg/kg to vary by 8% (p < 0.000) and 45% (p <0.001) respectively.

Key words: Oenothera rosea fibrinolytic, antiplatelet effect, flavonoids.

El Perú es uno de los países más destacados en diversidad biológica; existen alrededor de 25,0000 especies de plantas medicinales, mucha de las cuales poseen propiedades terapéuticas La Organización Mundial de la Salud reconoce la importancia del rol que desempeña el uso y utilización de las plantas medicinales en la "Atención Primaria de la salud"; recomienda y respalda su integración en los sistemas nacionales de salud; estima que casi el 80% de todos los habitantes de la Tierra los usan para resolver sus principales problemas de salud 1. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares, como el infarto al miocardio y accidente cerebro vascular, cobran 17,5 millones de vidas al año en el mundo y tienen como causa principal la trombosis o coagulación sanguínea en el interior de las arterias para producir estas enfermedades; entre otras. Para su tratamiento se dispone de varios grupos de medicamentos, denominados en conjunto como anticoagulantes; entre éstos se encuentran: antiagregantes plaquetarios, anticoagulantes orales y trombolíticos. Entre los antiagregantes plaquetarios reconocidos tenemos la Aspirina, pero produce inflamación gástrica como efecto adverso principal.

Oenothera rosea Aiton es conocida vulgarmente como chupasangre en la medicina tradicional peruana; es utilizada para diferentes tratamientos como: antiinflamatorio, para la neumonía, tuberculosis pulmonar, gonorrea y para nuestro interés, en hinchazones por su uso para absorber la sangre de los hematomas provocados por golpes y contusiones2

Las hojas de Oenothera rosea Aiton se colectaron en la comunidad campesina de San José de Huaylahichan, distrito de Acobamba, provincia de Tarma, departamento de Junín en el mes de abril del 2010

Doscientos veintiocho gramos de las hojas secadas y molidas de Oenothera rosea Aiton fueron macerados con 1400 ml de etanol 96% por 7 días con constante agitación y protegido de la luz en un frasco de color ámbar de boca ancha, el macerado fue filtrado sobre papel filtro; la solución extraída se guardó en un recipiente de vidrio de 5 L de capacidad. Una segunda maceración se realizó en las condiciones antes señaladas; se filtró y la solución extraída se adicionó al recipiente de vidrio de la primera maceración. Las soluciones filtradas se sometieron a evaporación en el evaporador rotatorio con baño María de 60 °C, obteniéndose treinta y dos gramos de extracto etanólico

Con la finalidad de detectar los diferentes constituyentes químicos del extracto etanólico desecado, se emplearon los siguientes ensayos:

En una batería de tubos de ensayo se colocó el extracto etanólico seco de las hojas de Oenothera rosea Aiton y se le agregó 2 ml del solvente en el siguiente orden: n- hexano, éter de petróleo, benceno, acetona cloroformo, acetato de etilo, 1-butanol, metanol, etanol y agua destilada

Se han realizado pruebas de color a través de reacciones cromogénicas, en tubos de ensayo para determinar los metabolitos primarios y secundarios más importantes, mediante la marcha fitoquímica preliminar.3,4.

Se realizó sobre papel Whatman Nº 1, cuya medida fue de 11 cm de ancho x 60 cm de largo; como fase móvil se usó BAA (1- butanol - ácido acético - agua, 4: 1: 5). Los cromatogramas obtenidos fueron examinados con luz UV y NH₃ / UV; cada banda fue cortada y eluida con metanol y analizada mediante la reacción de Shinoda; asimismo, se observó los desplazamientos de los máximos de absorción al agregar: MeONa, NaAcO, NaAcO/H3BO₃, AlCl₃ y AlCl₃/HCl a la solución metanólica de la banda con mayor concentración5, haciendo uso de un espectrofotómetro UV- visible.

Procedimiento: Se usó el método descrito por Prasad6, se hizo un ensayo como piloto con sangre venosa humana, proveniente de personas que no consumen anticonceptivos ni anticoagulantes, se pesaron inicialmente los tubos Eppendorf, se agregó 500 µl de sangre y se puso en la estufa a 37 ºC por 45 minutos; una vez formado el coágulo, se retiró todo el suero de la muestra por aspiración con micropipeta sin alterar el coágulo formado, se pesó nuevamente y se obtuvo por diferencia el peso del coágulo seco. Cada tubo Eppendorf que contuvo el coágulo se rotuló debidamente y se agregó 500 µl de la solución metanólica que contenían los flavonoides; nuevamente se pusieron en la estufa a 37 ºC por 90 minutos. Finalmente se removió el líquido de los tubos y se pesaron.

Se usó el método descrito por Prasad6, se trabajó con sangre venosa de 10 personas voluntarias, cuya edad promedio fue de 24 años, quienes nunca consumieron anticonceptivos ni anticoagulantes. Se pesaron inicialmente los tubos Eppendorf; se agregó 500 µl de sangre y se pusieron en la estufa a 37 °C por 45 minutos; una vez formado el coágulo, se retiró todo el suero de la muestra por aspiración con micropipeta sin alterar el coágulo formado; se pesó nuevamente y se obtuvo por diferencia el peso del coágulo seco. Cada tubo Eppendorf se rotuló debidamente y se agregó 500 µl del extracto etanólico seco a la concentración de 5,8 mg/ml previamente reconstituido en etanol al 96º; con el mismo procedimiento se trabajaron las concentraciones 0,29 y 0,014 mg/ml; nuevamente se colocaron en la estufa a 37 ºC por 90 minutos. Finalmente, se removió el líquido de los tubos y se pesaron. La prueba se repitió por triplicado, con un total de 90 tubos Eppendorf.

Siguiendo el método de CYTED7 para la actividad antiagregante plaquetario, se utilizaron 40 ratas albinas hembras cuyo peso fue 210 + 4 g las que fueron divididas en 5 grupos de 8 animales cada uno.

Grupo control: Se administró 5 ml/kg de suero fisiológico 5 ml/kg dos veces al día.

1er. grupo experimental: Se administró 25 mg/kg del extracto de chupasangre dos veces al día.

2do. grupo experimental: Se administró 50 mg/kg del extracto de chupasangre dos veces al día.

3er. grupo experimental: Se administró 100 mg/kg del extracto de chupasangre dos veces al día.

Grupo estándar farmacológico: Se administró 100 mg/kg de aspirina dos veces al día.

Los datos fueron agrupados y presentados en tablas, expresados en valores medios + error estándar, en un intervalo de confianza del 95%. Se ha tenido en cuenta una p<0,05 para considerar significativos los hallazgos. Se aplicó el análisis de varianza para establecer la significancia estadística del tratamiento. Se utilizó el programa estadístico SPSS, versión 13, año 2006; asimismo, los programas Word y Excel 2007.

El extracto etanólico de las hojas de O. rosea fue sometido al ensayo de solubilidad; para lo cual se hizo uso de un grupo de solventes ordenados de acuerdo a su polaridad (tabla 1).

Se determinó la presencia de taninos, saponinas, flavonoides, quinonas y alcaloides Los datos coinciden con los obtenidos por Gonzales y cols8, quienes realizaron un estudio fitoquímico comparativo entre Oenothera rosea y Oenothera multicaulis; sin embargo, los resultados reportados para Oenothera multicaulis coinciden con Oenothera rosea Aiton, planta estudiada en este trabajo de investigación; destacando que Oenothera multicaulis reporta tambien alcaloides y saponinas (tabla 2)

Los flavonoides fueron analizados y fraccionados por cromatografía en papel, en un sistema descendente; se obtuvo 16 fracciones de flavonoides, cuyas propiedades fluorescentes fueron analizadas en la lámpara de luz UV con y sin vapores de amoníaco, seguida de la reacción de Shinoda y su lectura en el espectrofotómetro UV - Visible (tabla 3).

Con la finalidad de obtener la posible estructura del flavonoide responsable de la actividad farmacológica, se realizó una prueba preliminar donde se detectó que la fracción 9 fue la que presentó mayor actividad en la prueba piloto; estos ensayos fueron complementados con las reacciones de desplazamiento9. Al tratarlo con metóxido de sodio hubo un efecto batocrómico de 14 nm (tabla 4), lo que nos indicaría que el compuesto tiene hidroxilos libres, principalmente en la posición 4´; al hacer reaccionar con tricloruro de aluminio se formó un complejo fuerte entre el carbonilo y el oxidrilo de la posición del C- 5; al agregarle el HCl el complejo formado no se descompuso lo que indicó la presencia de un oxidrilo en el C – 5 cuyo esqueleto básico correspondería al de una flavona; por consiguiente se propone la estructura siguiente (figura 1):