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Revista de la Sociedad Química del Perú
versión impresa ISSN 1810-634X
Rev. Soc. Quím. Perú v.78 n.4 Lima oct./dic. 2012
TRABAJOS ORIGINALES
Compuestos fenólicos y actividades antioxidante, antielastasa, anticolagenasa y fotoprotectora in vitro de Myrciaria dubia (camu camu) y Caesalpinia spinosa (tara)
Phenolic compounds and antioxidant, antielastase, anticollagenase and photoprotective in vitro activities of Myrciaria dubia (camu camu) and Caesalpinia spinosa (tara)
Víctor Hugo Doroteo1 , Cecilia Terry2 , Camilo Díaz3 , Abraham Vaisberg3 , Rosario Rojas1,3
1 Unidad de Investigación en Productos Naturales.
2 3QP SAC.
3 Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias y Filosofía. Universidad Peruana Cayetano Heredia, Av. Honorio Delgado 430, Lima 31, Perú. rosario.rojas@upch.pe
RESUMEN
Con miras a explorar el potencial de la tara (Caesalpinia spinosa) y el camu camu (Myrciaria dubia) para el desarrollo de bloqueadores solares naturales y productos antiedad, en el presente trabajo se evaluó sus actividades antioxidante, antielastasa, anticolagenasa y fotoprotectora in vitro. El extracto hidroalcohólico de tara mostró una buena actividad antioxidante en diferentes ensayos in vitro (DPPH, TEAC, radical hidroxilo, radical superóxido); asimismo, inhibe la enzima colagenasa con mayor potencia que el control positivo epigalocatequina galato (EC50 = 162,78 y 321,41 µg/ml, respectivamente). El extracto hidroalcohólico de camu camu, a pesar de su alto contenido de ácido ascórbico, no mostró una actividad antioxidante relevante; pero en cambio, en un cultivo de fibroblastos 3T3 se determinó que ejerce un buen efecto protector in vitro (43,6%) contra la radiación UV- B. Se recomienda estudiar la asociación de ambos extractos como base para el desarrollo de un producto antiedad o de un bloqueador solar con mecanismo de acción dual.
Palabras clave: antioxidante, camu camu, compuestos fenólicos, fotoprotección, tara, UV-B.
ABSTRACT
In order to explore the potential of tara (Caesalpinia spinosa) and camu camu (Myrciaria dubia) to develop natural sunscreen and anti-aging products, the present study evaluated their antioxidant, anti-elastase, anti-collagenase and photoprotective activities in vitro. The hydroalcoholic extract of tara showed good antioxidant activity in different in vitro assays (DPPH, TEAC, hydroxyl radical, superoxide radical), and it also inhibits collagenase enzyme better than the positive control epigallocatechin gallate (EC50 = 162.78 and 321.41 µg/ml, respectively). The hydroalcoholic extract of camu camu, despite its high content of ascorbic acid, did not show a significant antioxidant activity, but instead, in a culture of 3T3 fibroblasts it exerted at good protective effect in vitro (43.6%) against UV-B radiation. It is recommended to study the association of both extracts as a basis for developing an anti-aging product or a sunscreen with a dual mechanism of action.
Key words: antioxidant, camu camu, phenolic compounds, photoprotection, tara, UV-B.
INTRODUCCIÓN
Los efectos dañinos de la radiación solar sobre la piel son causados principalmente por la radiación ultravioleta, la cual se divide en la región UV-A (320-400 nm), UV-B (290-320 nm) y UV-C (200-290 nm). La radiación UV-C es filtrada por la atmósfera antes de llegar a la tierra, la radiación UV-B no es completamente filtrada por la capa de ozono y es causante principalmente del eritema en piel, la radiación UV-A llega hasta capas profundas de la dermis provocando el fotoenvejecimiento de la piel.1
La exposición de la piel a la luz solar genera la liberación de citoquinas pro-inflamatorias e inmunosupresoras. Asimismo, produce especies reactivas de oxígeno, las cuales reaccionan con el ADN, proteínas, ácidos grasos, causando envejecimiento prematuro de la piel caracterizado por hiper/hipopigmentación de la piel, pérdida de elasticidad, arrugas y riesgo de cáncer a la piel.2
En los últimos años se ha despertado en la población un gran interés por usar productos naturales botánicos para prevenir el daño inducido por la radiación UV. En tal sentido, las plantas más promisorias para prevenir los daños causados por la radiación solar son aquellas que posean actividad antiinflamatoria, inmunomoduladora y antioxidante.3
El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad antioxidante, antielastasa, anticolagenasa y fotoprotectora in vitro de dos extractos de plantas peruanas, tara y camu camu, con miras a explorar su potencial para el desarrollo de bloqueadores solares naturales y productos antiedad.
PARTE EXPERIMENTAL
Equipos. Espectrofotómetro Shimadzu UV/Vis 1240, lector de microplacas multifunción (Microplate reader CHAMELEON V).
Reactivos. 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), reactivo Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, ácido gálico, ácido ascórbico, ácido metafosfórico, 2,6- dicloroindofenol, galato de epigalocatequina (EGCG), NaCl, CaCl2, etanol, ácido 2,2'-azino- bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), persulfato de sodio, Trolox, hexacianoferrato de potasio, ácido tricloroacético, cloruro férrico, nitroazul de tetrazolio (NBT), NADH, metosulfato de fenazina (PMS), fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico, desoxiribosa, peróxido de hidrógeno, EDTA, ácido tiobarbitúrico, ácido tricloroacético, manitol, elastasa pancreática porcina, enzima colagenasa de Clostridium histolyticum, N-(2- hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)-etil)-glicina (Tricine), N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (AAAPVN), N-[3-(2-furil) acriloil]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) y bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Fueron adquiridos de SIGMA.
Muestras vegetales. Se colectó frutos maduros de Myrciaria dubia (camu camu) y vainas de Caesalpinia spinosa (tara). Las muestras vegetales fueron colectadas e identificadas por el biólogo Camilo Díaz. Las respectivas muestras botánicas fueron depositadas en el HEPLAME (Herbario de Plantas Medicinales, Sección de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia).
Preparación de extractos. Las muestras vegetales secas y molidas fueron extraídas con una mezcla de etanol y agua destilada (7:3) por 4 días a temperatura ambiente. Luego de la filtración, se procedió a evaporar el solvente en un rotaevaporador a temperatura menor de 40 oC. Los extractos hidroalcohólicos obtenidos fueron almacenados en la refrigeradora a temperatura menor de 4 oC hasta su uso.
Determinación de compuestos fenólicos: Se utilizó el método de Folin-Ciocalteu descrito por García et al.4 Se preparó una curva de calibración de ácido gálico cuyo rango de concentración fue de 1-5 mg/L. Los extractos hidroalcohólicos de las 2 muestras vegetales fueron evaluados a una concentración de 0,1 mg/mL. A 100 µL de la muestra se le añadió 250 µL de la solución de Folin-Ciocalteu (diluido 1 en 2 con agua milli-Q), se sonicó por 5 min, luego se le añadió 1250 µL de carbonato de sodio al 20% y 400 µL de agua ultra pura. Se agitó vigorosamente, se cubrió de la luz y se le llevó a reposo por 90 minutos a temperatura ambiente. Las absorbancias respectivas fueron medidas a 760 nm en un espectrofotómetro. Las muestras fueron analizadas por triplicado y el contenido de compuestos fenólicos totales fue expresado en mg de ácido gálico/g de extracto hidroalcohólico.
Contenido de ácido ascórbico. El contenido de ácido ascórbico fue determinado de acuerdo al método descrito por Lung et al.5 Se extrajo 20 mg del extracto hidroalcohólico con 2 mL de ácido metafosfórico al 1% por 45 minutos a temperatura ambiente; al cabo de ese tiempo se filtró. Se tomó 100 µL de la solución anterior y se le agregó 900µL de una solución de 2,6- dicloroindofenol (cuya absorbancia estaba entre 0,30 y 0,35 para asegurar que la lectura de la muestra se encuentre dentro del rango de las de los estándares), luego de 1 minuto se midió la absorbancia a 515 nm. El contenido de ácido ascórbico se determinó a partir de la recta de regresión obtenida con el ácido ascórbico estándar en las concentraciones de 1, 5, 10, 20, 30, 40 y 50 µg/mL. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Actividad antioxidante en el test de DPPH. Se evaluó la actividad antioxidante in vitro de los extractos hidroalcohólicos mediante el método de Mensor et al.6 Se preparó diluciones en etanol acuoso de los extractos hidroalcohólicos hasta obtener concentraciones de 0,0 a 150,0 µg/mL. Se mezcló 1,0 mL de cada una de las diluciones con 0,5 mL de una solución 0,3 mM de DPPH en etanol y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos, al término de los cuales se procedió a medir la absorbancia de la mezcla a 517 nm. Todas las pruebas se realizaron por cuadruplicado. Se calculó el porcentaje de actividad antioxidante de cada muestra de acuerdo a la siguiente fórmula:
La concentración del extracto hidroalcohólico que neutraliza al 50 por ciento de los radicales de DPPH (EC50, concentración efectiva media) se obtiene de la recta obtenida al graficar el porcentaje de actividad antioxidante versus la concentración de la muestra (µg/mL).
Actividad antioxidante total (TEAC). La capacidad antioxidante se determinó siguiendo el método descrito por Hazra et al.7 El radical ABTS+ fue generado al mezclar un volumen de solución 14 mM de ABTS con un volumen de la solución 4,9 mM de persulfato de sodio, seguido de incubación por 16 h en oscuridad. La solución del radical ABTS se diluyó con agua hasta obtener una absorbancia de 0,70 (± 0,2). Se mezcló 10 µL de los extractos hidroalcohólicos a diferentes concentraciones (0,05 a 10 mg/mL) con 1,0 mL de la solución de radical ABTS y se leyó la absorbancia luego de 6 minutos a una longitud de onda de 734 nm.
Se procedió de igual manera para medir la actividad antioxidante del estándar Trolox. Todas las pruebas se realizaron por cuadruplicado.
Se calculó el porcentaje de actividad antioxidante total (% AAT) mediante la siguiente fórmula:
El blanco consistió de la mezcla de 10 µL del extracto hidroalcohólico con 1,0 mL de agua destilada. El control consistió de la mezcla de 10 µL de etanol con 1,0 mL de la solución de radical ABTS.
Se calculó el porcentaje de inhibición de la formación de radicales ABTS y se graficó como una función de la concentración. Finalmente, se determinó el TEAC (trolox equivalent antioxidant concentration) dividiendo la pendiente de la gráfica de la muestra (extracto hidroalcohólico) sobre la pendiente de la gráfica para el estándar Trolox.
Inhibición del radical-anión superóxido. La actividad inhibitoria se evaluó usando el método descrito por Gupta et al.8 Se mezcló 1 mL de nitroazul de tetrazolio (NBT) 156 µM (en buffer fosfato 100 mM, pH 7,4) con 1 mL de NADH 468 µM (en buffer fosfato 100 mM, pH 7,4) y 0,1 mL del extracto hidroalcohólico o quercetina (a diferentes concentraciones finales entre 20 a 200 µg/mL), se mezcló y añadió 0,1 mL de metosulfato de fenazina (PMS) 60 µM (en buffer fosfato 100 mM, pH 7,4) para iniciar la reacción. La mezcla se incubó a 25 °C por 5 minutos y se leyó su absorbancia a 560 nm. Se realizó de manera similar un control sin muestra y se utilizó la quercetina como compuesto de referencia. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
El porcentaje de inhibición del anión radical superóxido fue calculado como:
Las EC50 (Concentración efectiva media) se calcularon por análisis de regresión lineal, en donde la abscisa representa las concentraciones de los extractos hidroalcohólicos y la ordenada el promedio de porcentaje de actividad antioxidante obtenido a partir de tres mediciones independientes.
Inhibición del radical hidroxilo. La actividad fue determinada de acuerdo al método descrito por Özyürek et al.9 Se mezcló 100µL de buffer KH2PO4KOH (100 mM, pH 7,4), 100µL desoxiribosa (15 mM), 50µL de ácido ascórbico (1 mM), 50 µL H2O2 (10 mM), 50µL de extracto hidroalcohólico (a las concentraciones finales de 5, 15, 25, 35 y 50 µg/mL), 100µL FeCl3 (500 µM) y 50µL EDTA (1mM). La mezcla de reacción fue incubada a 37 °C por 1 hora. Al final de dicho periodo de incubación se agregó 500 µL de ácido tiobarbitúrico (TBA, 1% w/v) seguido de la adición de 500 µL de ácido tricloroacético (TCA, 2,8% w/v). Las soluciones se pusieron en un baño de agua a 80 °C por 20 minutos para que desarrolle el color rosado del aducto malondialdehído-ácido tiobarbitúrico y luego la absorbancia se midió a 532 nm. Se realizó un control sin muestra y se utilizó al manitol como compuesto de referencia. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y se calculó el porcentaje de inhibición de formación de radical hidroxilo de acuerdo a la siguiente fórmula:
Las EC50 (Concentración efectiva media) se calculó por análisis de regresión lineal, en donde la abscisa representa las concentraciones de los extractos hidroalcohólicos y la ordenada el promedio de porcentaje de actividad antioxidante obtenido a partir de tres mediciones independientes.
Inhibición de enzima elastasa: El ensayo se llevó a cabo usando el método descrito por Thring et al.10 y consistió en incubar 25 µL de muestra (a las concentraciones finales de 5, 65, 125, 180 y 250 µg/mL) con 100 µL de la enzima elastasa pancreática porcina (PE, 2.5 µg/mL en agua HPLC) por 15 minutos y luego agregar 125 µL del sustrato N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN, 1,6 mM en buffer THAM, Sigma 7-9®, pH 8,0) para que la reacción se inicie. Luego de 11 minutos se midió la absorbancia a 410 nm usando una lectora de placas multifunción CHAMELEON V. Se realizó un control sin muestra y se utilizó galato de epigalocatequina (EGCG) como compuesto de referencia. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
El porcentaje de inhibición de la enzima elastasa se calculó mediante la siguiente fórmula:
Las EC50 (Concentración efectiva media) se calcularon por análisis de regresión lineal, en donde la abscisa está representada por las concentraciones de los extractos y la ordenada por el promedio de porcentaje de actividad antioxidante obtenido a partir de tres mediciones independientes.
Inhibición de enzima colagenasa: El ensayo se llevó a cabo usando el método descrito por Thring et al.10 y consistió en incubar 100 µL de muestra (a las concentraciones finales de 80, 160 y 250 µg/mL) con 260 µL de la enzima colagenasa de Clostridium histolyticum (ChC, 1,54 unidades/mL en buffer pH 7,5 de Tricine (N-[Tris(hidroximetil)metil]glicina) 50 mM con 400 mM NaCl y 10 mM CaCl2) por 15 minutos y luego se agregó 240 µL del sustrato N-[3-(2-furil) acriloil]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, 2 mM en buffer pH 7,5 de Tricine 50 mM con 400 mM NaCl y 10 mM CaCl2) para que la reacción se inicie. Luego de 5 minutos se midió la absorbancia a 348 nm usando un espectrofotómetro UV-Visible. Se realizó un control sin muestra y se utilizó galato de epigalocatequina (EGCG) como compuesto de referencia. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
El porcentaje de inhibición se calculó:
Las EC50 (Concentración efectiva media) se calcularon por análisis de regresión lineal, en donde la abscisa está representada por las concentraciones de los extractos y la ordenada por el promedio de porcentaje de actividad antioxidante obtenido a partir de tres mediciones independientes.
Inhibición de daño celular por radiación ultravioleta. Los fibroblastos BALB/c 3T3 fueron cultivados en medio de crecimiento Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) conteniendo 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mmol/L glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 µg/mL estreptomicina a 37 oC bajo atmósfera húmeda con 5% CO . Los fibroblastos fueron cultivados hasta llegar a un nivel de confluencia de 90-95% en placas de 24 pozos. El medio de crecimiento fue reemplazado 24 horas antes de agregar los extractos por DMEM conteniendo 0,1% FBS, 2 mmol/L glutamina, 100 U/mL penicilina y 100 µg/mL estreptomicina. Para el experimento se utilizó una lámpara de luz UV-B de longitud de onda máxima = 312 nm (sin emisión UV-A ni UV-C). Las células fueron pre-tratadas con el extracto hidroalcohólico a diferentes concentraciones por espacio de 4 horas, al cabo de las cuales fueron irradiadas con la luz UV-B por espacio de 90 segundos y con la lámpara UV a una altura de 20 cm. Justo antes de exponer las células a la radiación UV, las monocapas fueron lavadas con solución buffer fosfato salino (PBS) y expuestas en presencia de PBS. Luego de la irradiación, el PBS fue remplazado por DMEM conteniendo 1 % FBS, 2 mmol/L glutamina, 100 U/mL penicilina y 100 µg/mL estreptomicina. Las células fueron incubadas nuevamente por 24 horas al término de las cuales se cuantificó la viabilidad de las células por medio del cambio de color del reactivo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio), medido a la longitud de onda = 570 nm.11
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la tabla 1 se puede observar que el extracto hidroalcohólico de tara (EC50 = 4,97 µg/ml) posee buena actividad antioxidante en el ensayo de DPPH, la cual es inclusive mayor a la del control positivo, el flavonoide rutina (EC50 = 6,43 ± 0.22 µg/ml). Asimismo, el extracto de tara tiene una capacidad antioxidante total (TEAC, Trolox equivalent antioxidant concentration) similar a la del control positivo Trolox (94 versus 100%, respectivamente).
En el test de inhibición del radical superóxido, el extracto de tara presentó una actividad similar a la del control positivo quercitina (EC50 = 41,77 y 41,24 µg/ml, respectivamente). Sin embargo, dicho extracto no inhibe al radical hidroxilo (EC50 > 200 µg/ml).
A pesar de su alto contenido en ácido ascórbico (> 6%), el extracto de camu camu no presentó actividad antioxidante en los cuatro ensayos evaluados (tablas 1 y 2). Al parecer, la buena actividad antioxidante mostrada por el extracto de tara dependería en mayor medida de la concentración y tipo de compuestos fenólicos
La enzima elastasa es una proteasa que degrada la proteína elastina, la cual es sumamente importante para darle elasticidad a las arterias, pulmones, ligamentos y piel. La actividad de la enzima elastasa aumenta con el paso de los años, especialmente en personas mayores de 40 años de edad, lo cual conlleva a la disminución de la elasticidad de la piel y aparición de arrugas.12
El 80% del peso seco de la piel está constituido por la proteína colágeno, la cual es responsable del tono de la piel. La enzima colagenasa se encarga de romper los enlaces peptídicos del colágeno y se estima que sustancias que inhiban dicha enzima podrían ser usados como agentes preventivos de la aparición de arrugas.10
Se ha reportado estudios sobre la actividad de diversos extractos de plantas y aceites esenciales con actividad anticolagenasa y antielastasa,12-14 aunque hasta el momento ninguno de ellos fue realizado con plantas peruanas. En el presente trabajo de investigación se encontró que tanto la tara como el camu camu no poseen actividad antielastasa in vitro; sin embargo, el extracto de tara sí mostró una buena actividad anticolagenasa, inclusive mayor que la del control positivo EGCG (EC50 = 162,78 y 321,41 µg/mL, respectivamente) (tabla 3).
La radiación ultravioleta puede causar respuesta inflamatoria de la piel, daño del ADN, fotoenvejecimiento y fotocarcinogénesis. En los últimos años se ha venido incrementando el uso de extractos de plantas que puedan contrarrestar los efectos dañinos de la radiación ultravioleta. El efecto protector de las plantas contra la radiación UV se debería principalmente a su propiedad antiinflamatoria y antioxidante.11
El efecto protector del extracto hidroalcohólico de tara contra la irradiación UV-B fue evaluada a una concentración máxima de 10 µg/mL, ya que a concentraciones mayores producía mortalidad de los fibroblastos 3T3. A dicha concentración el extracto presenta sólo un efecto protector leve (8%).
El extracto de camu camu resultó ser menos tóxico contra los fibroblastos 3T3, por lo que pudo ser evaluado a concentraciones de hasta 200 µg/mL. A esta concentración, el camu camu presentó un efecto protector contra los rayos UV-B de hasta 43,6% (tabla 4).
Muchos autores coinciden en que los extractos de plantas y las sustancias naturales aisladas de ellas podrían ser usados como ingredientes para bloqueadores solares debido a sus propiedades antioxidantes y a su capacidad de absorber la luz ultravioleta.15 En nuestro estudio hemos encontrado 2 extractos hidroalcohólicos de plantas medicinales peruanas, uno preparado a partir de las vainas de la tara el cual a bajas dosis posee muy buena actividad antioxidante in vitro y otro a partir de los frutos maduros del camu camu, capaz de inhibir el efecto dañino de la radiación ultravioleta sobre los fibroblastos. Se recomienda investigar si la asociación de ambos extractos actúa en forma sinérgica, con miras a desarrollar un bloqueador solar natural con mecanismo de acción dual.
CONCLUSIONES
El extracto hidroalcohólico de tara mostró una buena actividad antioxidante en diferentes ensayos in vitro (DPPH, TEAC, radical hidroxilo, radical superóxido); asimismo, inhibe la enzima colagenasa con mayor potencia que el control positivo epigalocatequina galato. El extracto hidroalcohólico de camu camu, a pesar de su alto contenido de ácido ascórbico, no mostró una actividad antioxidante relevante; sin embargo, ejerce un buen efecto fotoprotector in vitro contra la radiación UV-B.
AGRADECIMIENTO
El presente trabajo de investigación fue llevado a cabo gracias al auspicio del FIDECOM- Innóvate Perú (Proyecto 148-FINCYT-FIDECOM-PIPEI-2010: Desarrollo y validación científica de ingredientes naturales basados en plantas medicinales y/o alimenticias de la biodiversidad peruana para la industria cosmética).
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Recibido el 07-11-2012
Aprobado el 15-11-2012