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Revista de la Sociedad Química del Perú

versão impressa ISSN 1810-634X

Rev. Soc. Quím. Perú vol.79 no.4 Lima out./dic. 2013

 

TRABAJOS ORIGINALES

 

Purificación y algunas propiedades de una hialuronidasa del veneno de la serpiente Bothrops brazili "jergón shushupe"

Purification and some properties of a hyaluronidase from bothrops brazili snake venom

 

Julio Delgadillo1, Mercedes Palomino1, Fanny Lazo1, Edith Rodríguez1, Edgar González, Ruperto Severino2 y ArmandoYarlequé1*

1 Lab. Biología Molecular-Facultad de Ciencias Biológicas-UNMSM
2 Lab. Zoología de Invertebrados-Facultad de Ciencias Biológicas-UNMSM
* ayarleque48@gmail.com

 


RESUMEN

En el veneno de la serpiente Bothrops brazili se ha encontrado una proteína con actividad hialuronidasa. La purificación se realizó en dos pasos cromatográficos utilizando columnas de Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50 equilibradas con buffer acetato de amonio 0,1 M, pH 5. Se obtuvo una purificación de 33 veces con un rendimiento de 54,5 % y una recuperación de proteína activa equivalente a 1,66 %. Esta enzima es una proteína básica con un peso molecular de 110 kDa y un pH óptimo de 5,5. La actividad enzimática a 20 °C se mantuvo en un 50% después de 72 horas y fue completamente inactivada a las 192 horas. Asimismo, la actividad enzimática se incrementó un 38,9 % por la adición de iones magnesio (150 mM). La capacidad difusora de esta proteína se demostró mediante el incremento de la actividad hemorrágica causada en ratones al adicionarse la enzima purificada. Los ensayos de toxicidad en ratones y las pruebas enzima –antivenenos, indicaron que la hialuronidasa carece de toxicidad y es inhibida totalmente por los antivenenos botrópico y lachésico (INS-Perú).

Palabras clave: Veneno, serpiente, hialuronidasa, Bothrops brazili, antiveneno.

 


ABSTRACT

In the venom of the snake Bothrops brazili was found a protein with hyaluronidase activity. The purification was performed by two chromatographic steps using SephadexG-75 and DEAE SephadexA-50 columns equilibrated with ammonium acetate buffer 0.1M, pH 5. The purification obtained was 33 fold with 54.5% of yield and a recovery of active protein was equivalent to 1.66%. This enzyme was a basic protein with a molecular weight of 110kDa and an optimum pH of 5,5. The enzymatic activity at 20 °C was maintained at 50% after 72 hours and was completely inactivated at 192 hours. Furthermore, the enzymatic activity was increased by 38.9% by the addition of magnesium ions (150mM). The diffusing capacity of the protein was demonstrated by increased hemorrhagic activity caused in mice when added to the purified enzyme. Toxicity assays in mice and enzyme- antivenoms assays indicated that hyaluronidase was not toxic and was completely inhibited by both polyvalent bothropic as monovalent lachesic antivenoms (INS-Perú).

Key words: Venom, snake, hyaluronidase, Bothrops brazili, antivenom.

 


INTRODUCCIÓN

La hialuronidasa es una endo-β-glicosidasa ampliamente distribuida en la naturaleza1. En algunos venenos ofídicos esta enzima hidrolítica produce daño tisular local con degradación de la matriz extracelular y del tejido conectivo que rodea a los vasos sanguíneos, ya que cataliza la ruptura de los enlaces glicosídicos (β-1,4) de los mucopolisacáridos ácidos tales como el ácido hialurónico y el condroitín sulfato. Asimismo los estudios sobre varias serpientes venenosas de las familias Viperidae y Elapidae, han demostrado que la hialuronidasa no sólo aumenta la potencia letal en la difusión de los venenos, sino que también daña el sitio de la mordedura, resultando en una morbilidad grave.

A pesar de su reconocida importancia fisiológica, esta enzima ha sido poco estudiada debido a su marcada inestabilidad, que conlleva a su rápida inactivación in vitro2.

La información sobre las hialuronidasas presentes en los venenos ofídicos en el Perú es aun escasa, a pesar de que ya se ha reportado su presencia y características en los venenos de Lachesis muta3,4 y Bothrops atrox5.

Bothrops brazili, es una especie que habita en América del Sur, reportándose su presencia en Brasil, Colombia, Ecuador, Guyana, Perú, Surinam y Guyana Francesa6. Su característica más importante es la de producir abundante cantidad de veneno (3-4 ml) en comparación con otros vipéridos7. Por ello, el ofidismo causado por esta especie tiene graves consecuencias, tanto por los componentes tóxicos presentes en su veneno como por el volumen que puede inocular. El estudio de este veneno y en especial de la enzima hialuronidasa de B. brazili tiene gran importancia, pues hasta la fecha no se había detectado su presencia, lo que abre un nuevo camino para investigar sus características y su acción en el proceso de envenenamiento en el cual estaría implicada. Es así que en el presente estudio se purificó y se caracterizó bioquímica y biológicamente esta enzima, la cual tiene gran relevancia por tratarse de un tema de salud pública.

PARTE EXPERIMENTAL

Material biológico

Veneno.- Se empleó veneno liofilizado de especímenes adultos de B. brazili procedentes de la zona del Alto Marañon-Amazonas, mantenidos en cautiverio en el Serpentario "Oswaldo Meneses" del Museo de Historia Natural de la UNMSM. La extracción del veneno se realizó por presión manual de las glándulas venenosas, siendo este fluído tóxico liofilizado y conservado a 4 °C hasta su uso.

Antivenenos.- Para el ensayo de inhibición enzimática se utilizó los sueros anti-botrópico polivalente y anti-lachésico monovalente al estado líquido, producido por el Instituto Nacional de Salud (INS-Lima-Perú).

Animales de experimentación.- Se empleó ratones albinos cepa Balb c machos (18-22g) procedentes del bioterio del INS.

Cuantificación de proteína

El contenido proteico del veneno crudo así como de las fracciones obtenidas fue cuantificado midiendo la absorbancia de luz UV a 280 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV 1208. Además, se empleó el método de Lowry, modificado por Loayza et al.9 utilizando el reactivo de Folin Ciocalteu 1:6 en medio alcalino en presencia de albúmina sérica bovina como proteína estándar, midiéndose la absorbancia a 660 nm.

Actividad enzimática

Para esta prueba se utilizó el método turbidimétrico de Di-Ferrante10. La mezcla de reacción contenía 0,2 mL de ácido hialurónico (0,5 mg/mL), 0,25mL de buffer acetato de amonio 0,05M a pH 5,0 con NaCl 0,15 M y se adicionó 0,05 mL del veneno (1mg/mL) o enzima purificada (0,1 mg/mL). Luego se incubó a 37°C por 15 minutos, deteniéndose la reacción con 2 mL de bromuro cetil trimetil amonio (BCTA) al 2,5% en NaOH 2%. Finalmente, se midió la turbidez a 400 nm. La actividad específica fue expresada en unidades Di-Ferrante (UDF) la cual se define como la cantidad de proteína requerida para reducir la turbidez inicial del sustrato en un 50%.

Purificación de la enzima

Para la separación de la hialuronidasa, se siguió el método desarrollado por González et. al.,5. Para lo cual 65 mg de veneno crudo fueron aplicados a una columna de Sephadex G-75 (50 x 1,1 cm) equilibrada con buffer acetato de amonio 0,1 M pH 5,0. Se colectó fracciones de 1 mL a un flujo de 8 mL/hora midiéndose en cada una la cantidad de proteína y la actividad de la enzima. Las fracciones que mostraron mayor actividad se juntaron y se aplicaron a una columna de intercambio aniónico sobre DEAE Sephadex A-50 (40 x 1,1 cm) equilibrada con el mismo buffer utilizado anteriormente. Se colectó volúmenes de 1 mLpor fracción a un flujo de 8 mL/hora.

Peso molecular

Se calculó siguiendo la metodología de LaemmLi11, usando geles de electroforesis de poliacrilamida-SDS al 10 % en presencia y ausencia de mercaptoetanol. Se utilizó el marcador molecular comercial Wako WIDE-VIEWTM que contiene proteínas marcadoras de pesos moleculares desde 7 hasta 240 kDa.

Determinación de la estabilidad

Los ensayos de estabilidad enzimática para el veneno y la enzima, se realizaron a 20 °C. Se monitoreó la actividad enzimática por el método de Di-Ferrante10 desde cero hasta 192 horas.

Determinación del pH óptimo

Alícuotas de la enzima fueron incubadas a diferentes pH: usando buffer acetato de amonio 0,1 M en el rango de pH de 5 a 6,5 y buffer Tris-HCl 0,1 M pH 7 y 8. Luego de 15 minutos de incubación a 37 °C se midió la actividad enzimàtica en cada uno de los valores de pH y se construyó la curva de pH resultante.

Efecto de iones mono y divalentes sobre la actividad enzimática

Se preparó baterías de reacción conteniendo: KBr, KCl, NaCl, CaCl2 y MgCl2 en concentraciones desde 0,01 a 0,3 M. Se preincubaron alícuotas de la enzima con los respectivos iones por 10 minutos a 37 °C y luego se midió la actividad enzimática de la mezcla de reacción.

Inhibición de la actividad hialuronidasa causada por sueros de origen equino

Se preparó mezclas de la enzima o veneno con los sueros anti-botrópico polivalente y lachésico monovalente a diferentes dosis: 2, 1, 1/2, 1/5 y 1/10 de acuerdo a la dosis neutralizante indicada por el INS (una dosis corresponde a 10 mL de suero que neutraliza 25 mg del veneno). Las mezclas veneno o enzima con el antiveneno fueron incubadas a 37°C por 15 minutos y luego se midió la actividad enzimática.

Determinación de la toxicidad

Cinco grupos de ratones albinos, fueron inoculados intraperitonealmente con 0,1 mL de hialuronidasa (5-20 µg). El control positivo se realizó con 0,1 mL de veneno crudo (1 mg/mL) y el control negativo con 0,1 mL de solución salina. Luego se monitoreó el efecto sobre los ratones durante 48 horas. Después de este tiempo, los ratones vivos se sacrificaron y se sometieron a disección para observar daños cutáneos y/o viscerales. El ensayo se realizó por triplicado.

Determinación de la actividad hemorrágica

Se empleó el método de Kondo modificado por Isla et al.12, para lo cual se preparó cinco muestras diferentes para su inoculación por vía intradérmica en ratones. La muestra 1 (M1) contenía el equivalente a 1 dosis hemorrágica mínima (1 DHM) del veneno total de B. brazili que corresponde a 6,17 µg, de acuerdo al estudio previo de Isla et al.12. La muestra 2 (M2) contenía el equivalente a 1 DHM previamente calentado a 60 °C por 10 minutos. Asimismo la muestra 3 contenía 6,17 µg de la hialuronidasa en estudio. La muestra 4 contenía 1 DHM del veneno más la enzima purificada y la muestra 5 contenía veneno inactivado por calor más la enzima. Luego de dos horas, los animales fueron sacrificados y se les removió la piel de la zona abdominal para calcular el diámetro y el área hemorrágica en un papel milimetrado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Purificación de la enzima

La hialuronidasa del veneno de la serpiente B. brazili se purificó mediante dos pasos cromatográficos sobre una columna de Sephadex G-75 seguida de una de intercambio aniónico sobre DEAE Sephadex A-50 (figuras 1 y 2). Con este procedimiento se logró una purificación de 33 veces, un rendimiento de 54,5% y una recuperación de proteína activa equivalente al 1,66 % (tabla 1).

 

 

 

 

 

 

Asimismo la enzima fue analizada por PAGE-SDS bajo condiciones reductoras y no reductoras obteniéndose un peso molecular de 110 kDa.

Aunque los estudios de las hialuronidasas de origen animal no son muy abundantes, se ha reportado varias de ellas, como es el caso de la que está presente en el veneno de la serpiente asiática Agkistrodon acutus acutus para lo cual se utilizó sucesivamente: CM Sephadex C-50, Sephadex G-75 y CM Sephadex C-25 (Xu et al 13), obteniéndose una purificación de 45 veces y un rendimiento de 6 %. Asimismo, se ha encontrado hasta dos isoformas en el veneno de la serpiente Agkistrodon contortrix contortrix utilizándose columnas de Sephacryl S-200 HR y CM-Sephadex C-25, respectivamente; se obtuvo una purificación de 277 veces con un rendimiento del 16,6 % y una recuperación de proteína de 0,1 % 14. Así también, el veneno de la cobra africana Naja naja fue fraccionado a través de columnas de Sephadex G-75 seguida por CM Sephadex C-25, encontrándose dos isoformas de la enzima denominadas NNH1 y NNH215; en este caso se registró una purificación de 33 veces, un rendimiento de 5 % y una recuperación de proteína de 0,15 % para la NNH1 y de 27 veces con un rendimiento de 0,35 % y una recuperación de 0,01 % para la NNH2. En el Perú, el primer estudio reportado acerca de esta enzima fue usando el veneno de L. muta4 utilizándose una columna de intercambio catiónico sobre CM Sephadex C-50 con una purificación de 26,4 veces, un rendimiento de 23,5 %. En el 2006, empleándose el mismo veneno de L. muta Lerma3 optimizó este método, empleando columnas de Sephadex G-100 seguida por CM Sephadex C-50, y de este modo se purificó 51,4 veces con un rendimiento de 38,6 %. Recientemente, González et al.5, aislaron esta enzima a partir del veneno de la serpiente B. atrox, la más abundante y peligrosa del país. Para ello utilizaron dos pasos cromatográficos : DEAE Sephadex A-50 seguido de Sephadex G-50 obteniéndose una purificación de 145 veces con un rendimiento de 72 %.

Al comparar estos datos con el presente estudio se observa que la aplicación de dos pasos cromatográficos uno de los cuales es una filtración molecular, da lugar a una apropiada separación de esta proteína cuya masa molecular está dentro de las mayores del veneno; asimismo, sea un intercambiador aniónico o catiónico el cual es seleccionado previos ensayos, se puede optimizar la purificación y el rendimiento. Nótese que los datos reportados por González et al5. indican valores muy elevados de purificación y de rendimiento para el veneno de B. atrox lo que podría estar asociado a un inhibidor intrínseco de la enzima en ese veneno; este comportamiento no se aprecia en el veneno de L. muta ni en el de B. brazili, motivo de esta investigación presente.

En el año 1992, Cevallos et al.16, en un estudio sobre serpientes de Costa Rica encontraron al evaluar zimogramas en PAGE-SDS conteniendo ácido hialurónico; pesos moleculares de 113 y 137 kDa para esta enzima en Bothrops asper, 73 y 108 kDa para Crotalus basilicus y de 115 kDa en el caso de Lachesis muta. Asimismo, para el veneno de Agkistrodon contortrix contortrix se ha reportado pesos moleculares de 59 y 61 kDa para sus respectivas isoformas14, mientras que en el caso de los elápidos, como la cobra Naja naja 15, se ha registrado pesos moleculares de 70 y 52 kDa. Por otra parte, en el Perú para el caso de B. brazili es evidente que tratándose de una proteína de alto peso molecular de 110 kDa, este valor es similar con el de B. atrox registrada por González5, lo que podría interpretarse como signo de homología molecular a nivel del género Bothrops.

Determinación de la estabilidad

La figura 3 nos muestra la baja estabilidad de la hialuronidasa de B. brazili ya que mantuvo su actividad sólo hasta las 96 horas teniendo un 41 % de actividad remanente en este tiempo, en tanto que a las 192 horas la actividad enzimática fue nula. La rápida inactivación de hialuronidasa por exposición a temperatura ambiente (20º-25ºC) es una constante en la mayoría de los venenos de serpientes por lo que continúa su exploración de las condiciones óptimas para lograr mantenerla activa por un periodo prolongado, teniendo en cuenta que la mayor parte de las enzimas ofídicas son estables por varias semanas a esta exposición

 

 

pH óptimo

En relación con este parámetro la hialuronidasa de B.brazili mostró un máximo valor de actividad a pH 5,5, con un rango entre pH 5 y 6,5 mientras que a pH de 7 y 8 la actividad disminuye drásticamente. Esto concuerda con los estudios previos sobre la marcada inestabilidad de esta enzima a pH neutro y ligeramente alcalino en los que contrariamente son estables la mayoría de los componentes del veneno.

Valores de pH óptimo de 5 fueron encontrados en los venenos de Agkistrodon acutus13, Heloderma horridum horridum 17, en la serpiente peruana Lachesis muta 4 así como en las dos isoformas del veneno de Naja naja 15. En cambio, en los venenos de las serpientes Agkistrodon contortrix contortrix 14 y de Bothrops atrox 5 (Perú) se encontró valores de pH óptimo de 6. Como puede observarse, es posible correlacionar el pH óptimo con los valores de máxima estabilidad que se encuentran en un estrecho rango de pH entre 5 y 6,5. Desde el punto de vista fisiológico esto podría significar que las hialuronidasas permanecen muy activas en el pH glandular (pH 4,5-5) y que pueden funcionar con alta eficiencia al penetrar el veneno en el tejido conectivo donde el principal componente es el ácido hialurónico.

Efecto de iones sobre la actividad enzimática

Los resultados obtenidos al preincubar la enzima con los iones a concentraciones finales (10 - 300 mM), se muestra en la tabla 2. Como puede notarse, el ion Mg+2 causó la máxima activación inicial con un valor del 38,9 % a la concentración de 150 mM, mientras que , Ca+2 (150 mM) y el K+ (300 mM) sólo mostraron un ligero incremento de la actividad en un 5,3 % y 10%, respectivamente (tabla 2).

 

 

Existe numerosos estudios que demuestran la influencia de los cationes divalentes en la actividad de las enzimas de origen ofídico. En relación con la hialuronidasa, Lerma3 mostró que los aniones monovalentes Cl- y Br- elevaron la actividad de la enzima purificada del veneno de L. muta y no los cationes Na+ y K+. En nuestro caso el propósito fue verificar si el ion Mg+2, un típico activador enzimático en las ponzoñas de serpientes, tenía alguna acción sobre hialuronidasa de B. brazili. Los resultados indicaron que si bien se observa activación, esta es moderada ya que no supera el 39 %. En cuanto a los aniones Br y Cl -no muestran mayor efecto sobre esta enzima.

Acción de los antivenenos equinos sobre la enzima

Con respecto a la capacidad neutralizante de los antivenenos comerciales, empleando concentraciones equivalentes a 2, 1, ½, 1/5 y 1/10 dosis neutralizantes, se observa que ambos sueros son capaces de inhibir totalmente la actividad de esta enzima. Es interesante apreciar que la inhibición por el suero antilachésico monovalente es más notoria que la causada por el suero antibotrópico polivalente a pesar que este último contiene anticuerpos IgG específicos contra el veneno de B. brazili . Nótese que el efecto inhibitorio producido por los antivenenos es similar sobre el veneno total y sobre la enzima purificada.

Con los dos sueros a 1/2, 1 y 2 dosis hubo neutralización total de la actividad. Con el antiveneno botrópico con 1/5 y 1/10 de dosis para las pruebas con veneno total se observó una reducción de la actividad del 74,6 y 40 %, en tanto que con la enzima purificada se obtuvo una reducción del 62,7 % y 36,3 % . En cambio, con el antiveneno lachésico a las mismas dosis frente al veneno total se observó una reducción de un 80,7 y 45 %; para el caso de la enzima purificada los valores fueron 69,8 y 39 %, respectivamente (tabla 3).

 

 

Previamente se reportó la neutralización por el antiveneno botrópico polivalente de las actividades enzimáticas de los venenos crudos de serpientes del género Bothrops, observándose que la hialuronidasa de B. brazili fue inhibida completamente18 a valores de 1/2, 1 y 2 dosis. González et al.5 observaron un alto grado de neutralización de la enzima en el , veneno de B. atrox causada por acción de los sueros antibotrópicos y antilachésicos de origen equino y aviar, respectivamente lo que indica que a pesar de la baja reactividad cruzada ambos sueros son capaces de inhibir toda la actividad enzimática. Esto implicaría que por lo menos para el caso de la hialuronidasa de B. brazili es válido usar cualquiera de los dos antivenenos pero, además, obliga a realizar nuevos estudios sobre la estructura antigénica de esta enzima y ubicar sus epitopos presentes en los anticuerpos IgG e IgY.

Análisis de la toxicidad y de la capacidad difusora de la enzima

En cuanto a las pruebas de toxicidad en ratones inoculados con la enzima por vía intraperitoneal no se detectó ningún efecto ni signo de toxicidad hasta las 48 horas. Con ello se demuestra que esta enzima carece de toxicidad, lo cual también ha sido reportado para las hialuronidasas de Agkistrodon acutus acutus13, Agkistrodon contortrix contortrix14 y Lachesis muta3. Respecto a estos resultados se afirma que la hialuronidasa no es tóxica en la naturaleza, en contraste con otros principios tóxicos contenidos en los venenos de serpientes15.

Los ensayos de actividad hemorrágica en piel de ratón realizados con veneno total, calentado previamente a 60 ºC, la enzima purificada y la enzima adicionada al veneno crudo y al veneno previamente calentado demostraron que la hialuronidasa carece de acción hemorrágica pero que añadida al veneno calentado, este efecto biológico se incrementa hasta 3,5 mm. Asimismo, el cálculo de la DHM para el veneno total corresponde al encontrado por Isla et al.12 cuyo valor fue de 6,17 µg .Es también interesante observar que el valor de hemorragia producido por el veneno total también se incrementa de 10 mm a 12 mm al adicionar la enzima purificada. Estos resultados muestran que monitoreando la actividad hemorrágica es posible verificar la participación en este proceso de la hialuronidasa, gracias a su capacidad difusora, aunque esta proteína carece de dicha actividad. Un modelo semejante se realizó evaluando hemólisis en placa, para demostrar el efecto difusor de la enzima (Lerma3, González et al.,5)

CONCLUSIONES

Los resultados del presente trabajo establecen la presencia de una proteína enzimática del tipo hialuronidasa a partir del veneno de la serpiente peruana Bothrops brazili la cual es de naturaleza básica con un peso molecular de 110 kDa y un pH óptimo de 5,5. La enzima es activada por el ion magnesio, carece de toxicidad y es neutralizada por los sueros antibotrópico polivalente y antilachésico monovalente producidos por el INS-Perú. También tendría una acción difusora del veneno en procesos biológicos asociados al envenenamiento, como la hemorragia.

AGRADECIMIENTOS

Los autores de este artículo agradecen al Consejo Superior de Investigación del Vicerrectorado de Investigación de la UNMSM, por su apoyo financiero.

 

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Recibido el 30-09-2013
Aprobado el 25-10-2013