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INTRODUCCIÓN
La extracción de fluidos supercríticos (SFE) es una tecnología ecológica, el uso de CO2 supercrítico (SC- CO2) es el más ampliamente utilizado debido a que no es tóxico, no inflamable, no corrosivo y fácil de manipular, lo que permite operación a bajas presiones supercríticos y cerca de la temperatura ambiente. El CO2 supercrítico (SC- CO2) es barato y está fácilmente disponible en cantidades a granel con un alto grado de pureza, asegurando una alteración mínima de los compuestos bioactivos y para preservar sus propiedades curativas o funcionales, posee la capacidad de solubilizar sustancias lipofílicas y puede ser fácilmente eliminado de los productos finales. Es una técnica respetuosa con el medio ambiente y generalmente reconocida como segura “GRAS”1,2,3.
Se realizaron investigaciones sobre la extracción de aceite de semillas de sésamo utilizando CO2 supercrítico; los parámetros de la presión, temperatura, caudal del CO2 supercrítico y tamaño de partículas sobre el rendimiento de extracción, un aumento de la presión y el caudal de CO2 supercrítico mejoró el rendimiento de extracción y también acortó el tiempo de extracción, el rendimiento de extracción aumentó a medida que el tamaño de partícula disminuyó dependiendo de la disminución de la resistencia a la difusión intrapartícula, el máximo rendimiento de extracción obtenido fue de aproximadamente el 85 % a condiciones de presión de 350 bar, 2 ml de CO / min, 300-600 µm de tamaño de partícula4.
En otro estudio similar se obtuvo aceite de semilla de Cucurbita maxima empleando el proceso de extracción con CO2 supercrítico, logrando un rendimiento de 31,5 % a las condiciones de 120 minutos, 65°C, 29,630 KPa5. Asimismo, se obtuvo aceite de semillas de maracuyá, lulo y mora, mediante una extracción con fluidos supercríticos utilizando como solvente al CO2, se realizó a diferentes condiciones de presión y temperatura obteniéndose los mejores rendimientos en maracuyá 15,7 %, mora 14,5 % y lulo 12,3 %, a una presión de 350 bar y de temperatura de 60°C, en los tres aceites se encontraron los ácidos grasos linoleico, linolénico, oleico, palmítico, palmitoleico y esteárico, también encontraron el β-sitosterol, escualeno en maracuyá, γ-sitosterol en lulo y γ-tocoferol en mora. Las caracterizaciones fisicoquímicas presentaron valores dentro de los estándares de calidad que requieren los aceites para consumo6.
También hay otros estudios de la obtención de aceite de granadilla por métodos de solventes y extracción por presión obteniendo el rendimiento de 23,48 % y 18,58 % respectivamente7. Se reportaron otros métodos como la extracción acuosa asistida por surfactante (SAAE) para extraer el aceite de semillas de maracuyá a temperatura ambiente (25°C), se logró una extracción de (80,%), se encontró que el aceite contenía fenoles (26,3 mg GAE / g), escualeno (0,65 mg / g), β-sitosterol (0,58 mg / g) y vitamina E (0,1 mg / g). Los principales ácidos grasos libres presentes fueron linoleicos (65,72%), oleico (17,9%) y palmítico (11,41%)8.
Por otro lado, se realizaron estudios del aceite de semilla de Cucurbita pepo L. donde evaluaron sus propiedades funcionales sobre la cicatrización de heridas en ratas, reportaron resultados favorables, logrando una cicatrización eficiente de la herida, además la evaluación morfo métrica y los hallazgos histológicos revelaron biopsias curadas del grupo tratado con aceite de Cucurbita pepo L, a diferencia del grupo no tratado, por lo que se atribuye a este aceite propiedades de un fármaco prometedor para curar heridas debido a su excelente calidad de aceite, por su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (ácido linoleico: 50,88 ± 0,106 g / 100 g de ácidos grasos totales), tocoferoles (280 ppm) y esteroles (2086,5 ± 19,092 ppm), por lo que recomiendan su utilización en la nutrición y para fines medicinales9, igualmente pueden ser empleadas las semillas de Cucurbita maxima, debido a su contenido alto de ácidos grasos insaturados10. También en otros aceites de semillas como Persea americana mostró una actividad antioxidante promisoria, que puede ser empleado para propósitos nutricionales e industriales y debido a sus componentes bioactivos pueden ser usados en formulaciones farmacéuticas11.
En esta investigación el objetivo es obtener aceite de la semilla de granadilla (Passiflora ligularis) y zapallo (Cucurbita maxima) a través del empleo de CO2 supercrítico y su análisis de ácidos grasos, tocoferoles y fitoesteroles, para su aplicación en la alimentación humana.
PARTE EXPERIMENTAL
Preparación de los subproductos de la granadilla y zapallo
Los frutos de la granadilla y zapallo se sometieron a un lavado, desinfectado, y se pelaron y se separaron, la cáscara, pulpa y semilla. La semilla se lavó, oreó y ambas se sometieron a deshidratado 60°C x 24 horas y empacadas en papel kraft, la molienda de ambas muestras en un molino de laboratorio (BOSCH-Type KM13, Germany), tamizado con tamiz N° 70 (212 µm), donde se obtuvieron harinas de semillas, envasadas y almacenadas.
Análisis químico
El análisis químico proximal de las semillas secas de granadilla y zapallo se realizaron según las técnicas de la AOAC, (1998)12, donde se determinaron:
Humedad. Contenido de agua en las semillas por el método de secado a una temperatura de 65ºC basado en al análisis de Weende (AOAC 977.11)
Cenizas. Por el método de incineración en el horno mufla donde se produce la ignición de la materia orgánica y quedando como residuo la materia inorgánica (AOAC 942.05)
Grasa total. Por el método Soxhlet, donde se determinó el porcentaje de grasa total en la semilla (AOAC 920.39).
Proteína total. Por el método químico de Kjeldalh (%proteína = %N2 x 6,25) por digestión ácida y alcalinización donde se libera el amoniaco por destilación y posterior titulación (AOAC 955.04).
Fibra cruda. Por digestión con ácido sulfúrico y con hidróxido de sodio con el fin de eliminar las proteínas, carbohidratos solubles, residuos de grasas y vitaminas (AOAC 962.09).
Extracto libre de nitrogenado. Se calcula por diferencia aritmética después de sumar los contenidos de humedad, cenizas, grasa, proteínas, fibra cruda y se resta de 100.
Extracción con CO2 supercrítico de aceites de semillas
La extracción de aceite de semilla de granadilla y zapallo se llevó a cabo utilizando un sistema de extracción de CO2 supercrítico, en el equipo extractor supercrítico WATERS Modelo S.N. 4373385-USA incorporada con una bomba P-50. Para cada ensayo de extracción, se pesó 50 g de semillas secas en forma de harina con un tamaño de partícula de 212 µm y se colocó en la columna de extracción. El extracto se recogió en viales de recolección y se cerró herméticamente previo burbujeo de nitrógeno. Los parámetros de extracción fueron: 350 bar de presión, 50ºC de temperatura y 3mL/min de caudal de CO2 supercrítico13.
Análisis de composición de ácidos grasos
La determinación de la composición de ácidos grasos del aceite de semilla de zapallo se llevó a cabo utilizando el cromatógrafo de gas con detector de Ionización de llama Clarus 690 - Perkin Elmer y una columna analítica HP-5MS (30 mx 0,25 mm). Se utilizó software Totalchron Workstation como sistema de análisis de datos, del cromatógrafo de gases, luego elevado a 210ºC a 45ºC / min. el volumen de inyección fue 1 µL usando helio como gas portador14.
Análisis de las características físicas y fisicoquímicas
Los índices de refracción, acidez, yodo, peróxidos, saponificación y densidad, se determinaron en base a los métodos recomendados por la AOAC (1998)12
Análisis de tocoferoles
La cuantificación se llevó a cabo en base a la metodología recomendada por Amaral et al.15. El tamaño de muestra fue de 300 mg, al cual se adicionó 75 µl de solución de butilhidoxitolueno (10 mg/ml de hexano). La fase móvil para la separación cromatográfica fue una mezcla de hexano/dioxano (95.5:4.5, v/v). Este método consiste en una extracción simplificada sólido- líquido, el extracto obtenido luego fue inyectado en el UHPLC - Nexera X2 - LC 30AD- Shimadzu - Japón para su cuantificación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Composición química de las semillas de granadilla y zapallo
La composición química de la semilla de la granadilla (Passiflora ligularis Juss) evaluada presenta alto contenido de grasa (28,81 %) y proteína (18,59 %) (tabla 1), estos valores son similares a los encontrado para maracuyá (Passiflora edulis), grasa (27,6 %) y proteína (15,2%), reportados por Pantoja et al.6, en cuanto al contenido proteico fue mayor comparado con 13,65 % reportado por Torres7, que investigó en semilla de granadilla procedente de Cajamarca-Perú. Para la semilla de zapallo se encontró un alto contenido de proteína (38,35%) y grasa (24,47 %) encontrándose valores diferentes a los reportados por Rezig et al.16, para Cucurbita maxima producida en Tunisia, encontraron proteína (33,92 %) y grasa (31,57%), pero sí se encontró similitud a los reportados por Raczyc et al.17, para la Cucurbita pepo, grasa (34,35 %) y proteína (22,13 %), estas diferencias evidentemente es debido al lugar de procedencia de las cucurbitáceas y estos resultados nos refieren que debido a su alto contenido de extracto etéreo de las muestras de semillas pueden ser una fuente promisoria de aceite.
Tabla 1. Composición química proximal de semilla granadilla y zapallo (g/100 g).
| Componentes g/100g | Semilla de granadilla | Semilla de zapallo |
| Humedad | 6,09 ± 0,09 | 7,20 ± 0,11 |
| Proteínas | 18,59 ± 0,73 | 38,35 ± 0,33 |
| Grasa | 28,81 ± 0,49 | 24,47 ± 0,36 |
| Fibra | 2,45 ± 0,1 | 12,56 ± 0,21 |
| Cenizas | 2,49 ± 0,14 | 4,95 ± 0,08 |
| ELN | 41,58 ± 1,04 | 12,47 ± 0,90 |
Resultados promedio ± SD (n=3).
Características fisicoquímicas
En la tabla 2 se observan los valores de las características fisicoquímicas de los aceites de semilla de granadilla y zapallo, presentan un índice de refracción (IR) de 1,461 y 1,463 y densidad relativa de 0,92 y 0,93 respectivamente, estos valores son similares a los reportados por Rezig et al.16, que reportaron en aceite de semilla de Cucurbita maxima un IR de 1,46 y densidad relativa de 0,91, mientras que en otra investigación realizada por Uba y Muhammad14 encontraron valores menores para aceite de semilla de zapallo un IR de 1,120 y densidad relativa 0,892, estas diferencias podrían deber su naturaleza fisicoquímica debido a su lugar de procedencia y método de extracción, ya que el índice de refracción de los aceites depende de su peso molecular, longitud de la cadena de ácidos grasos y grado de insaturación de cada tipo de aceite18.
El índice de saponificación en las muestras de aceite de semilla de granadilla 186,09 mg KOH/g y zapallo 174,09 mg KOH/g (tabla 2), estos valores son similares a los hallados en aceite de semilla de Cucurbita maxima por Rezig et al.16 (175 mg KOH/g) y menores a los reportados por Uba Muhammed14 (260,87 mg de KOH/g) y Mitra et al.5 (260,87 mg de KOH/g), estos resultados menores se explicarían por su bajo contenido de ácidos grasos saturados, ya que los aceites con altos valores de índice de saponificación presentan alta proporción de grasas saturadas19. En lo referente al índice de acidez hallado en las muestras de aceite de semilla de granadilla 1,71 mg KOH/g, es un valor similar a lo reportado por Torres7 para aceite de semilla de granadilla proveniente de Cajamarca-Perú reporta 1,75 mg KOH/g y en el aceite de semilla de zapallo se encontró el índice de acidez de 1,65 mg KOH/g, este valor es menor a los hallados en aceite de semilla de Cucurbita maxima por Mitra et al.5 (5,57 mg de NaOH/g), por Rezig16 (7,54 mg de NaOH/g) y Uba y Muhammed14 (6,92 mg KOH /g). La diferencia encontrada en las investigaciones probablemente se debe a la diferencia de los métodos de extracción. Por otro lado, también estos valores hallados de índice de acidez en la presente investigación, son menores a los máximos permisibles en las normatividades del códex alimentario20, que indica que para aceites vírgenes el índice de acidez debe ser menor a 4,0 mg KOH/g.
El índice de yodo hallado del aceite de semilla de granadilla 142,46 g I2 /100 g aceite y de zapallo 133,69 g I2 /100 g aceite (tabla 2), estos valores difieren de los reportados en aceite
de semilla de Cucurbita maxima por Mitra et al. 5 (115 g I /100 g aceite), por Rezig et al.16
(153,66 g I2 /100 g aceite) y por Uba y Muhammed (80-100 g I / 100g). Los resultados obtenidos son altos debido a la presencia de ácidos grasos insaturados. El valor de yodo se usa para determinar la insaturación, sin embargo, cuando el valor del índice de yodo es alto, la estabilidad del aceite se reduce porque es más probable que ocurra oxidación19, por lo que podríamos decir que estos aceites son muy sensibles a la oxidación.
El índice de peróxidos de la muestra de aceite de granadilla presenta 4,12 meq de O2/kg siendo un valor menor comparado a lo hallado por Torres7 de 6,66 meq de O /kg extraído por prensado y de 15,37 meq de O2/kg extraído por solvente. El índice de peróxido de aceite de semilla de zapallo presenta 1,73 meq de O2/kg estos son valores menores a los reportados en Cucurbita maxima por Mitra et al. 5 (3,46 meq de O2/kg), por Rezig et al.16 (2,33 meq de O2/kg). Estos valores de peróxidos hallados para aceite de granadilla y zapallo son menores a los indicados como valor máximo permisible en el códex alimentario20 que indica hasta 15 meq de O /kg de aceite para aceites vírgenes. Estos aceites se encuentran aptos para consumo humano.
Los valores de características fisicoquímicas de los aceites evaluados en general presentan diferencias con los resultados de otras investigaciones, esto probablemente es debido al lugar de cultivo de las muestras de zapallo, asimismo al método de extracción o también debido al tiempo de almacenamiento21.
Tabla 2 Características fisicoquímicas del aceite de semilla de granadilla y zapallo (g/100 g) obtenido por CO2 supercrítico.
| Componentes g/100g | Semilla de granadilla | Semilla de zapallo |
| Índice de refracción (40ºC) | 1,461 ± 0,01 | 1,463 ± 0,01 |
| Densidad relativa a 20ºC | 0,92 ± 0.,2 | 0,93 ± 0,08 |
| Índice de saponifocación (mgKOH/g de aceite) | 186,09 ± 1,62 | 174,09 ± 1,54 |
| Índice de yodo (g I 2 /100 g aceite) | 142,46 ± 0,89 | 133,69 ± 1,55 |
| Índice de peróxido (meq O2 / kg de aceite) | 4,12 ± 0,15 | 1,73 ± 0,06 |
| Índice de acidez (mg KOH/g de aceite) | 1,71 ± 0,06 | 1,65 ± 0,45 |
Resultados promedio ± SD (n=3).
Composición de ácidos grasos
El aceite de semillas de granadillas (tabla 3) presenta valor alto de ácidos grasos insaturados de 82,37 %, siendo mayor el ácido araquidónico 74,22 %, luego cantidades menores de ácido oleico, palmítico y esteárico y una cantidad menor de linolénico, estos resultados son similares a los reportados por Torres7, que encontró en el aceite de semilla de granadilla extraído por prensado 85,72 % de ácido araquidónico, 12,41 % de ácido oleico y 1,88 % de ácido esteárico y la diferencia es que no encontró ácido palmítico.
En lo que respecta al aceite de semilla de zapallo presenta un valor alto de ácidos grasos insaturados de 76,01 %, siendo el más alto el ácido linoleico 44,32 %, ácido oleico 31,23 %, en menor cantidad el ácido palmítico, ácido esteárico y mínima cantidad de ácido linolénico y mirístico, estos resultados son similares a los encontrados por Mitra et al.5, en aceite de semilla de Cucurbita maxima extraído por fluidos supercríticos con CO2 que encontraron ácido linoleico 45,5 %, oleico 29,5 % y en menor cantidad el palmítico y esteárico, estas semejanzas es debido al método aplicado, que es similar a lo aplicado en la presente investigación, ya que en otras investigaciones en aceite de Cucurbita maaxima extraídos por otros métodos se encontraron diferencias. Rezig et al.16 obtuvieron el aceite mediante extracción por presión y reportaron como mayor componente el ácido oleico 44,11 %, linoleico 34,77 %, araquidónico 0,41 % y en otra investigación de extracción del aceite por solvente eter, Uba y Muhammad14, encontraron en mayor cantidad el ácido linoleico 53,42 %, linolénico 20,92 %, palmítico 17,53 % y ácido esteárico 8,13 %. Estas diferencias encontradas en el aceite se semilla de zapallo probablemente se deben a la diferencia de la zona de cultivo21 y métodos aplicados para la extracción. También se observó la relación de ácidos grasos insaturados / ácidos grasos saturados, para aceite de semilla de granadilla y zapallo 4,73 y 3,19, respectivamente, estos valores nos indican su alto contenido de ácidos grasos insaturados en relación a los ácidos grasos saturados, por lo que estos aceites serían recomendables para ser considerados en consumo humano.
Tabla 3 Composición de ácidos grasos del aceite de semilla de granadilla y zapallo (g/100 g) obtenido por CO2 supercritico.
| Componentes g/100g | Semilla de granadilla | Semilla de zapallo |
| Ácido mirístico (C14 : 0) | - | 0,13 ± 0,06 |
| Ácido palmítico (C16:0) | 7,24 ± 0.10 | 12,53 ± 0,40 |
| Ácido estearico (C18:0) | 1,82 ± 0,07 | 7,60 ± 0,33 |
| Ácido oleico (C18:1) (ω-9) | 7,32 ± 0,14 | 31,23 ± 1,27 |
| Ácido araquidónico (C:20:4) | 74,22 ± 1,93 | - |
| Ácido linoleico (C18:2) (ω-6) | - | 44,32 ± 0,92 |
| Ácido α-linolenico ( C18: 3) (ω-3) | 0,83 ± 0,05 | 0,46 ± 0,01 |
| Ácidos grasos saturados | 17,63 ± 2,09 | 23,99 ± 2,04 |
| Ácidos grasos insaturados | 82,37 ± 2,09 | 76,01 ± 2,04 |
| AGI /AGS | 4,73 ± 0,71 | 3,19 ± 0,36 |
| C:18:1 / C18:2 | - | 0,71 ± 0,02 |
Resultados promedio ± SD (n=3). AGI: Ácidos grasos insaturados, AGS: Ácidos grasos saturados
Composición de tocoferoles y fitoesteroles
En la tabla 4, se observa los resultados de α-Tocoferol de aceite de semilla de granadilla y zapallo 17,85 µg/ g y 33,67 µg/ g, respectivamente, el proveniente de semilla de granadilla presenta menor contenido que el proveniente de semilla de zapallo, sin embargo este último se encuentra dentro del rango reportado por Stevenson et al. 21, indican un contenido de tocoferoles en el aceite de semillas de zapallo (Cucurbita maxima) de 27,1 a 75,1μg/g de α-tocoferol. La presencia de tocoferoles es importante porque está relacionado con la conservación del aceite, al respecto, Wang22, menciona que la autooxidación del aceite deteriora la calidad del mismo y este tipo de deterioro puede ser disminuido por los tocoferoles debido a su capacidad de controlar la oxidación del aceite. Además, es importante porque los tocoferoles son ingredientes no glicéridos y son considerados antioxidantes lipolíticos naturales, se sugiere que estos bloquean las reacciones de conversión de radicales lipolíticos23, debido a ello se asocian con la prevención de enfermedades como Alzheimer y cancerosas24.
También se encontró β-sitosterol en granadilla y zapallo 13,56 mg/100g y 19,50 mg/100g, respectivamente, los valores son superiores a lo reportado por Surlehan8 en aceite de semilla de maracuyá 0,582 mg/g de β-sitosterol y son inferiores a los reportados por Ryan25, que indican que en la composición de los fitoesteroles en semilla de zapallo se encuentran de 24,9 mg/100g de β-sitoesterol y de 8,4 mg/100g de estigmaesterol, respectivamente. Estos fitoesteroles son importantes porque se relacionan con la disminución del colesterol y efectos fisiológicos en la salud humana21, además son componentes valorables en la industria cosmética, debido a que ayuda a curar la piel dañada de manera efectiva, debido a que tiene una estructura similar al colesterol26. También ayuda a controlar enfermedades de la piel como eczema y sarna8. Los aceites obtenidos de semilla de granadilla y zapallo presentan componentes bioactivos, por lo que se sugiere que pueden ser empleados en la industria alimentaria y farmacéutica.
Tabla 4 Composición de tocoferoles y fitoesteroles del aceite de semilla de granadilla y zapallo obtenido por CO2 supercrítico.
| Componentes | Semilla de granadilla | Semilla de zapallo α- |
| Tocoferol ( µg/ g) | 17,85± 1,37 | 33,67± 3,85 |
| β-sitosterol (mg/100g) | 13,56± 2,38 | 19,50± 2,47 |
2,47 Resultados promedio ± SD (n=3).
CONCLUSIONES
El aceite de las semilla de granadilla y zapallo, obtenido por CO2 supercrítico, presentan características fisicoquímicas que se encuentran dentro de los valores aceptables de aceites comestibles y presentan alto contenido de ácidos grasos insaturados en aceite de semilla de granadilla (82,37 %) y aceite de semilla de zapallo (76,01 %), siendo el ácido graso insaturado más abundante en la semilla de granadilla el ácido araquidónico (74,22 %), y en la semilla de zapallo el ácido linoleico (44,3 %). Además, contienen componentes bioactivos α-tocoferol y β-sitosterol. Estos aceites obtenidos son buenas fuentes de aceites comestibles para uso en la dieta alimenticia, debido a su alto contenidos de ácidos grasos insaturados y contenido de α-tocoferol como antioxidante natural, que pueden ser empleados como ingredientes industriales en la producción de cosméticos y complementos alimenticios.
