Obtención de las muestras

La muestra de Buddleja inkana Ruiz & Pav., de la familia Loganiaceae (quisuar); fue recolectada en la provincia de Canta (Lima) e identificada por el biólogo Severo Baldeón Malpartida (constancia No. 072-USM-2018). La muestra de Oreocallis grandiflora (Lam) R. Br., de la familia Proteaceae, fue recolectada en marzo del 2018 en la carretera Tiambra, hacia arriba de la quebrada, km 14 desde Huasahuasi, provincia de Tarma (Junín). Es un arbusto de 1-2 m de alto, con flores de color rosado fucsia y su hábitat es matorral; fue identificada por la bióloga Asunción Cano Echevarría (constancia No. 071-USM-2018). La muestra de Chuquiraga spinosa Less ''huamanpita'', de la familia Astereaceae, fue recolectada en febrero del 2018 en el distrito de Huaros, provincia de Canta (Lima). Es un arbusto espinoso con 0,5- 1,5 m de alto, flores anaranjadas, crece en matorral en zona rocosa dominada por arbustos de Baccharis sp. y Lupinus sp.; fue identificada en el Museo de Historia Natural de la UNMSM por el biólogo Severo Baldeón Malpartida (constancia No. 070-USM-2018).

Obtención de los extractos

Para la preparación de los extractos se seleccionó solo las hojas de la muestra bruta de cada planta: Buddleja incaka, Oreocallis grandiflora y Chuquiraga spinosa. Para la extracción por maceración las hojas fueron limpiadas, secadas bajo sombra durante 21 días, molidas con un molino de mano y tamizadas en tamiz N° 40. Para la extracción se utilizó 50 g de la muestra molida en 100 mL de solvente, es decir, etanol absoluto y soluciones hidroalcóholicas al 75 y 50 % (v/v) en etanol. La maceración se realizó en caliente a 40 °C durante 4 días, en este periodo de tiempo la muestra se sonicó y filtró 5 veces, las primeras por gravedad usando papel filtro rápido y la última por filtración al vacío; al cuarto día se obtuvo el extracto líquido que fue secado en una estufa a 40 °C hasta obtener el extracto sólido. Los extractos, así obtenidos, fueron utilizados para realizar las pruebas de actividad antioxidante: FRAP, DPPH y ABTS·⁺, así como la determinación de flavonoides y compuestos fenólicos totales.

Tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico, conocido también como marcha fitoquímica, es un método cualitativo que permite identificar, de manera preliminar, los diferentes componentes o metabolitos secundarios presentes en una planta. El tamizaje fitoquímico de las tres plantas se realizó usando 10 g de las hojas secas, molidas y tamizadas de cada planta y siguiendo los procedimientos descritos por Lock7 para la identificación de metabolitos en cada planta.

Determinación de antioxidantes

Se empleó como solvente al metanol absoluto, se preparó 3 mL de la solución de cada extracto de las plantas: Buddleja inkana, Oreocallis grandiflora y Chuquiraga spinosa a una concentración de 5 mg/mL en metanol. Se pesó 150 mg de cada muestra, se llevó al ultrasonido por 5 min, después se introdujo en un vórtex. Las plantas con su respectiva concentración en etanol e hidroalcohólicas se identificaron; en etanol absoluto: Buddleja inkana (B ABS.), Oreocallis grandiflora (O ABS.), y Chuquiraga Spinosa (C ABS.), al 75 % (v/v) en etanol: Buddleja inkana (B 75), Oreocallis grandiflora (O 75) y Chuquiraga spinosa (C 75) y al 50 % (v/v) en etanol: Buddleja inkana (B 50), Oreocallis grandiflora (O 50) y Chuquiraga spinosa (C 50). Las mezclas, ya disueltas, se pasaron por un filtro de 22 μm y se realizó las pruebas de FRAP, DPPH, ABTS·⁺, flavonoides y compuestos fenólicos totales⁸.

Poder Antioxidante de Reducción Férrica (FRAP), en lector de micro placa (modificado para etanol):

Este ensayo se basa en la capacidad de reducir el ion Fe⁺³ a Fe⁺² en presencia del TPTZ (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-ácido carboxílico) formando un complejo azul intenso de Fe-TPTZ con una absorbancia máxima de 593 nm. La absorbancia es proporcional al contenido de antioxidantes.

Para el ensayo se mezcló 290 µL de solución de trabajo (preparada a partir de 1 mL de solución tampón 300 mM (3,1g de CH₃COONa·3H₂O y 16 mL de ácido acético glacial), 1 mL de 20 mM FeCl₃·6H₂0 en solución acuosa en 0,02M HCl, 1 mL de 10 mM TPTZ disuelto en etanol y 11 mL de etanol) y 10 µL de muestra en un pocillo de microplaca, se esperó 15 min y se midió la absorbancia a 593 nm. Las mediciones se realizaron por triplicado. La curva de calibración se obtuvo usando una solución de Trolox, ver figura 1. Los resultados se expresaron en mg de equivalentes de Trolox/g de planta.

Figura 1 Curva de calibración de Trolox. 

Decoloración del radical ABTS·⁺(ácido 2,2′-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico))

en lector de micro placa: Para el ensayo, se prepararon 5 mL de solución acuosa 7 mM de ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) y 5 mL de solución acuosa 2,45 mM de persulfato de potasio, las cuales luego se mezclaron en proporciones (1:1) y se dejó incubar por 16 h en oscuridad, generando una disolución color verde cuya absorbancia se midió a 734 nm. Una alícuota de dicha solución se diluyó con una solución tampón fosfato salino hasta alcanzar un valor de absorbancia de 0,7. Para el ensayo se mezcló 275 µL de dicha solución y 25 µL de muestra en un pocillo de microplaca y luego de 5 min de reacción se midió la absorbancia a 734 nm. Se usó como estándar de control el ácido gálico.

La ecuación 1 permite calcular el porcentaje de actividad antioxidante (AA) de los extractos para los ensayos DPPH y ABTS·⁺:

En base a las curvas de concentración vs. porcentaje de actividad antioxidante se obtuvieron los coeficientes de inhibición al 50 % de actividad, IC₅₀, de los extractos y del estándar control. La determinación del porcentaje de actividad antioxidante relativa (% AAR) de los extractos de hojas para los ensayos DPPH y ABTS se realizó usando la ecuación 2:

Donde:

IC_{50 (M)}: Coeficiente de inhibición de la muestra.

IC_{50 (R)}: Coeficiente de inhibición del estándar de control.

Flavonoides en lector de micro placa:

Los flavonoides son los más comunes ^{antioxidantes}, el estándar a comparar fue la quercetina, ver figura 2. Para el ensayo se mezcló 160 µL de solución acuosa de NaNO₂ 0,85 % p/v y 30 µL de muestra en un pocillo de la microplaca y se esperó 6 min. Se agregó 18 µL de solución acuosa de AlCl3 10 % y se esperó 5 min. Posteriormente se agregó 120 µL de mezcla básica (preparada usando 1 mL de etanol absoluto con 3,1 mL de NaOH 0,645 M). Se homogenizó la mezcla mediante pipeteo y se medió inmediatamente la absorbancia a 510 nm. Las muestras se midieron por triplicado. Los resultados fueron expresados en mg quercetina equivalente (AG)/ g de planta.

Figura 2 Curva de calibración de Quercetina. 

Fenoles totales en lector de micro placa:

Para el ensayo se mezcló 165 µL de solución de reactivo Folin-Cicalteu (preparada usando 1 mL del reactivo en 139 mL de agua) con 15 µL de muestra en un pocillo de microplaca, se esperó 5 min. Se agregó 120 µL de solución acuosa de Na₂CO₃ 7 % p/v y se midió a 750 nm. Se realizó la curva de calibración con una solución alcohólica de ácido gálico (AG), ver figura 3. Los resultados fueron expresados en mg ácido gálico equivalente (AG)/ g de planta. Este procedimiento se efectuó por triplicado con cada uno de los extractos.

Figura 3 Curva de calibración de ácido gálico. 

Obtención de los extractos

La cantidad de extracto obtenido para cada planta en solución fue: 2,8, 4,7 y 2,5 g para B ABS., B 75 y B 50, respectivamente; 1,7, 1,9 y 4,1 g, para O ABS., O 75 y O 50, respectivamente; 1,5, 2,5 y 1,5 g, para C ABS., C 75 y C 50, respectivamente. En general, la Buddleja inkana fue la planta que mostró la mayor extracción con los diferentes solventes y que los solventes hidroalcohólicos favorecieron la extracción de metabolitos, probablemente debido a la solubilidad de algunos metabolitos en presencia de agua.

Tamizaje fitoquímico

Los resultados obtenidos en la determinación de la composición química de las distintas fracciones de cada una de las plantas estudiadas se muestran en la tabla 1. El tamizaje fitoquímico mostró la presencia de fenoles, taninos, esteroides, triterpenoides, alcaloides, saponinas y leucoantocianinas, metabolitos que pueden ser usados en diversas aplicaciones^1,2.

Actividad antioxidante

Ensayo de ABTS˙⁺

En la tabla 4 se muestra los IC₅₀ y AAR (%) de los extractos estudiados, así como del estándar control, evidenciando que los extractos O 75, B 75 y C 75, al igual que en el ensayo DPPH, exhiben una mejor actividad antioxidante comparado con los demás extractos estudiados. De forma similar a lo evidenciado en los ensayos anteriores, la actividad antioxidante por ABTS de los extractos de Oreocallis grandiflora fue mayor que la exhibida por los extractos de Buddleja inkana. Comparando los valores de IC₅₀ para los extractos estudiados, el valor de 4,69 μg/mL fue el más bajo alcanzado para el extracto O 75. Sin embargo, no tiene una buena capacidad antioxidante respecto al estándar patrón de ácido gálico. Los extractos que mostraron la mayor actividad antioxidante relativa fueron los extractos O 75 y O ABS., con valores de 9,60 y 10,84 %, respectivamente; verificando que a menor valor mayor capacidad antioxidante.

Los valores de AAR (%) reportados para extractos metanólicos y etanólicos de la Calamintha grandiflora¹⁶, especie perteneciente a la misma división y especie de la Oreocallis grandiflora, fueron de 18,67 y 23,56 %, respectivamente; indicando una mayor actividad antioxidante que los extractos de hojas de la Oreocallis grandiflora.

En la figura 4, se muestra que los valores de la concentración de los extractos para IC₅₀, calculados por el ensayo de DPPH son mayores que los calculados para el ensayo de ABTS˙⁺. El ensayo ABTS muestra una mayor sensibilidad a la actividad antioxidante. Los extractos O 75 y O ABS. mostraron los valores de IC50 más bajos para ABTS˙⁺ y una mayor actividad antioxidante por ambos métodos.

Figura 4 Actividad antioxidante por ensayos de DPPH y ABTS˙⁺. 

Contenido de flavonoides y fenoles totales

En la tabla 5, se muestra los resultados obtenidos en la medición del contenido de flavonoides. Los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de la Buddleja inkana mostraron de 2 a 3 veces mayor el contenido de flavonoides que los extractos de Oreocallis grandiflora y Chuquiraga spinosa.

En la tabla 6, se muestra los resultados obtenidos en la medición del contenido de fenoles totales. Los extractos alcohólicos e hidroalcohólicos al 75 % (v/v) de etanol de las tres plantas en estudio mostraron los mayores contenidos de flavonoides y polifenoles totales, resultado que mantiene correlación con la elevada actividad antioxidante reportada en los ensayos FRA, DPPH y ABTS·⁺.

El contenido de fenoles para extractos metanólicos de la Oreocallis grandiflora¹³ reportaron valores de 17,4 mg Ácido Gálico/100 mg de extracto, este resultado es tres veces menor al obtenido para el extracto etanólico en estudio. Otros estudios de contenido de flavonoides realizados solo a extractos etanólicos al 96 % de hojas de Chuquirga spinosa¹⁷ obtuvieron como resultado 80 mg quercetina/g y en el extracto de estudio se obtuvo entre 5,51 y 111,11 mg quercetina/g de planta. En el mismo estudio, el resultado de fenoles totales fue mayor a 100 mg ácido gálico/g extracto seco casi cuatro veces más a nuestro extracto hidroalcohólico de 75 % con 24,89 mg ácido gálico/g planta. Otros estudios de flavonoides realizados a extractos metanólicos de hojas de Buddleja saligna⁹ determinaron 1,61 mg de quercetina/g de planta seca comparado con el valor obtenido de los extractos estudiados entre 118,52 a 369,24 mg de quercetina/g planta. Un estudio realizado solo a extractos etanólicos de la Buddleja inkana¹⁸ de dos diferentes lugares de Ecuador reportó para fenoles totales valores entre 27,47- 47,40 mg de ácido gálico/g de extracto, comparados a los obtenidos entre 82,29 - 172,58 mg de ácido gálico/g de extracto.