INTRODUCCIÓN

La contaminación del ambiente con productos orgánicos como por ejemplo los plaguicidas, los cuales tienen movilidad en los suelos y solubilidad en el agua¹, han sido un grave problema los últimos años, ya que estos han tenido un fuerte impacto tanto en la salud humana como en la salud animal.

Se registraron antecedentes en las ciudades de Piura², Huancayo^3,4 con respecto al uso de estos plaguicidas del tipo carbamatos, que son moléculas derivadas del ácido carbámico⁵, las cuales son transportados hacia las aguas subterráneas y otros efluentes naturales por medio de la lixiviación del suelo⁶. Los carbamatos como el aldicarb y carbofurano, objeto de este trabajo, se degradan en el ambiente formando metabolitos como son el aldicarb sulfona, aldicarb sulfóxido y carbofurano-3-hidroxi^7,8, los cuales tienen efectos más nocivos en los seres vivos. Dada esta problemática en nuestro país se procedió a analizar los suelos, para la identificación y cuantificación de estos carbamatos y sus metabolitos por medio de la técnica de cromatografía líquida acoplado a la espectrometría masas (UHPLC/MS/MS), la separación cromatográfica es posible gracias a la diferencia de polaridades, se podrá obtener cada molécula en su debido tiempo de retención con la ayuda de la fase estacionaria y la fase móvil^9,10, las moléculas separadas cromatográficamente, se ionizan en el detector masas con ionización electrospray (ESI), formando los iones precursores, y pasan a través de los cuadrupolos, se dan las condiciones del equipo necesarias como la energía de colisión para la fragmentación de los iones precursores en la Celda de colisión, generando los iones productos, los cuales ayudaron a la identificación del analito según la m/z y el ion ratio¹¹. Son necesarios los tratamientos estadísticos para la evaluación de los parámetros de validación tales como la precisión, veracidad, linealidad, rango de trabajo, sensibilidad, selectividad, límite de detección, límite de cuantificación e incertidumbre¹².

En la presente investigación se tiene como objetivo validar un método analítico con mayor sensibilidad para la cuantificación de carbamatos en suelos agrícolas por UHPLC/MS/MS, con tiempo corto de análisis y con un límite de cuantificación de 5 ug/L, en comparación con otros métodos¹³, los cuales tienen tiempo de análisis largos y límites de cuantificación más altos, y cumpliendo con parámetros de validación para garantizar la confiabilidad de los resultados obtenidos.

PARTE EXPERIMENTAL

Reactivos: Se utilizó Agua Ultrapura con Componentes Orgánicos Totales (TOC) < 5 ug/L, Acetonitrilo con pureza al ≥99,9 %, sales de extracción que contienen: 4g de MgSO ₄ + 1g de NaCl + 1g de citrato de sodio dihidratado + 0,5 g de hidrogencitrato de sodio sesquihidratado, sales de limpieza que contiene MgSO ₄ y PSA (amina primaria y secundaria), ácido fórmico (HCOOH) grado PA (para análisis) diluído al 5%, Metanol con pureza al ≥99,9 %, formiato de amonio (HCOONH ₄ ) con una concentración de 5M, mezcla de estándares que contengan aldicarb, aldicarb sulfona, aldicarb sulfóxido, carbofurano, carbofurano-3-hidroxi.

Equipos y Materiales: Balanza Analítica con una resolución de 0,0001g, Centrífuga hasta 3500rpm, congeladora.

Condiciones Cromatográficas: UHPLC modelo NEXERA acoplado a un detector masas triple cuádruplo modelo LC-MS 8060-NX, para la identificación de los analitos de interés, trabajando con un volumen de inyección de 0,5 uL, fase móvil compuesta de una fase A: (Agua Ultrapura con Componentes Orgánicos Totales (TOC) < 5 ug/L) 90% / (Metanol con pureza al ≥99,9 %) 10% / 1mL HCOONH ₄ 5M) y una fase B: (Metanol con pureza al

≥99,9 %) 90% / (Agua Ultrapura con Componentes Orgánicos Totales (TOC) < 5 ug/L) 10%

/1 mLHCOONH ₄ 5M), la fase estacionaria es una columna Phenomenex Synergi 2,5 µm Fusion-RP (50mm x 2,00mm x 2,5mm) a 40°C, con la siguiente gradiente (Tabla 1):

El detector masas con un capilar de ionización ESI en modo positivo, temperatura de desolvatación de 486°C, flujos de gas de secado y calentamiento a 10L/min y voltaje del detector 1,96 KV, con la interface de Electrodo de Focalización de iones, el cual se encuentra alrededor del spray generado por el ESI y por medio de campos electromagnéticos, focaliza los iones de interés, desechando los componentes orgánicos propios de la muestra.

Preparación del Estándar: Se usaron soluciones madre de aldicarb, aldicarb sulfona, aldicarb sulfóxido, carbofurano y carbofurano-3-hidroxi de 1000 mg/L en acetonitrilo, con micropipetas de 100 uL y 1000 uL se prepararon diluciones hasta llegar a una solución de trabajo que contiene todos los analitos a una concentración de 2 mg/L.

Colecta de suelos: Se recolectaron las muestras de suelos agrícolas en las localidades de Huancayo, Piura e Ica, se colectaron los suelos a una profundidad de 20 cm. Inmediatamente se guardaron en frascos de vidrio ámbar dentro de una caja térmica a una temperatura entre 6 a 10°C hasta la llegada al laboratorio, donde se procedió al tamizaje de la muestra con una malla de < 2 mm.

Preparación de la muestra: Se pesó 2,0000 g de muestra en balanza analítica, luego se agregó 10 mL de agua Agua Ultrapura con TOC < 5 ug/L y se agitó por 2 min. Luego se adicionó 10mL de Acetonitrilo con pureza al ≥ 99,9 % y se agitó por 2 min. Se agregaron las sales de extracción 4g de MgSO ₄ + 1g de NaCl +1g de citrato de sodio dihidratado + 0,5 g de hidrogencitrato de sodio sesquihidratado y se agitó por 2 min, finalmente se centrifugó por 5 min.

Para la limpieza (clean-up), se tomó una alícuota de 6 mL de la parte orgánica del extracto anterior (acetonitrilo) y vertió en un cartucho con las sales de limpieza, las cuales contienen MgSO ₄ y la amina primaria y secundaria PSA, es recomendable hacer este procedimiento el breve tiempo posible para no eliminar o dañar los analitos que puedan estar presentes en la muestra, se agitó por un minuto y centrifugó por 1 min respectivamente. Luego se pasó por un filtro de jeringa de nylon de 22 µm a un vial de 5 mL, después se tomó una alícuota de 1000 uL y se llevó a un vial de 1,5 mL, y se añadió 10 µL de ácido fórmico HCOOH al 5%, finalmente due agitado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La cuantificación de los analitos es realizada mediante la curva de calibración, preparada con extracto de muestra de suelo agrícola limpia (blanco), con un criterio de aceptación para el r² > 0,9900.

Figura 1 Curva de calibración de aldicarb (día 3) 

Figura 2 Curva de calibración de aldicarb Sulfona (día 3) 

Figura 3 Curva de calibración de aldicarb sulfóxido (día 3) 

Figura 4 Curva de calibración de carbofurano (día 3) 

Figura 5 Curva de calibración de carbofurano-3-hidroxi (día 3) 

Como se aprecia en la tabla 2 y las figuras de 1,2,3,4, 5, el r² de todos los analitos en 3 días diferentes cumplen con el criterio de aceptación, un valor mayor a 0,9900 según el Laboratorio de referencia de la Unión Europea (EURL) y 0.9950 según la Agencia de Protección ambiental de Estados Unidos (EPA).

Para evaluar la exactitud, primero se tuvo que evaluar el tipo de distribución de los datos obtenidos de las 10 repeticiones durante tres días diferentes, con la prueba de Anderson- Darling.

Con los valores-p obtenidos en la prueba de Anderson-Darling en la tabla 3, se dedujo que los datos obtenidos de todos los analitos en los 3 días diferentes tienen una distribución normal. La precisión se analizó con las pruebas ANOVA y Barlett, de acuerdo a los resultados de la tabla 4 todos los analitos en 3 días diferentes tienen igualdad de medias.

Con los valores-p obtenidos en la prueba de Barlett, se infiere, que los datos obtenidos en todos los analitos en los 3 días diferentes tienen igualdad de varianzas.

En la tabla 6, se puede apreciar que los porcentajes de recuperación de las fortificaciones se encuentran dentro del rango de tolerancia entre el 70% al 120%, este rango de recuperación es sugerido por la EURL-2021 y el EPA 2012, cumpliendo con la veracidad del método.

Para el cálculo teórico del LD y el LC, se procedió a usar las ecuaciones de las rectas obtenidas desde la figura 1 hasta la figura 5 y reemplazándolas en las ecuaciones ENT#091;1ENT#093; y ENT#091;2ENT#093;, los resultados se muestran en la tabla 7

El cálculo experimental de los LD y LC se realizó con fortificaciones de 1ug/L, la evaluación consistió en la relación de alturas de cada analito con respecto a la altura promedio de la señal ruido, para el LD (relación 3:1) y LC (10:1) como mínimo respectivamente, resultados en la tabla 8.

De manera experimental se confirmó el LD como se aprecia en la tabla 8, teniendo una altura promedio de la señal ruido, y el pico de cada analito a 1ug/L tiene una altura que es más de lo que indica la relación de 3:1, en donde se acepta el límite de detección a 1ug/L.

Según la tabla 9, y tomando en cuenta lo que el vocabulario internacional de metrología (VIM), se puede apreciar que el Aldicarb es el analito menos sensible en este grupo de carbamatos y el carbofurano es el analito con más sensibilidad.

Para la selectividad, se eliminaron las impurezas propias de la matriz del suelo, y no hay interferencias en los picos cromatográficos debido al trabajo de limpieza (Clean up), y por el primer filtro de iones de los electrodos de Focalización de iones.

Para la estimación de la incertidumbre se toma en cuenta los factores que intervienen en el resultado en C(mg ⁄ Kg), que se expresa en la ecuación ENT#091;3ENT#093;.

Tabla 10 Incertidumbres de los factores que intervienen en el resultado de C(mg ⁄ Kg)). 

analitos	días	Uc(ug/mL)			Umet
Aldicarb	1	0,0002	0,0289	8,07E-05	0,001648	0,06647	0,01336	0,12
	2	0,0005	0,0289	8,07E-05	0,002924	0,06647	0,01336	0,12
	3	5,81E-08	0,0289	8,07E-05	0,001262	0,06647	0,01336	0,12
Aldicarb Sulfona	1	9,57E-07	0,0289	8,07E-05	0,001234	0,07357	0,009429	0,15
	2	0,001659	0,0289	8,07E-05	0,008343	0,07357	0,009429	0,15
	3	5,92E-09	0,0289	8,07E-05	0,001235	0,07357	0,009429	0,15
Aldicarb Sulfóxido	1	5,92E-09	0,0289	8,07E-05	0,001194	0,08835	0,006613	0,18
	2	0,0002361	0,0289	8,07E-05	0,001679	0,08835	0,006613	0,18
	3	1,02E-08	0,0289	8,07E-05	0,001175	0,08835	0,006613	0,18
Carbofurano	1	1,82E-09	0,0289	8,07E-05	0,001448	0,006048	0,007786	0,020
	2	2,15E-07	0,0289	8,07E-05	0,001419	0,006048	0,007786	0,020
	3	2,00E-09	0,0289	8,07E-05	0,001415	0,006048	0,007786	0,020
Carbofurano-3-hidroxi	1	1,31E-08	0,0289	8,07E-05	0,001304	0,06475	0,01724	0,13
	2	0,002432	0,0289	8,07E-05	0,01216	0,06475	0,01724	0,14
	3	0,003423	0,0289	8,07E-05	0,01707	0,06475	0,01724	0,14

Para la incertidumbre de la concentración de curva, se usó la siguiente ecuación:

Se analizaron los suelos provenientes de las ciudades de Ica y Piura, que tuvieron como resultado negativo en los analitos de interés en este trabajo de investigación, mientras que el suelo proveniente de la ciudad de Huancayo tuvo resultado positivo en Carbofurano y Carbofurano-3-hidroxi como se muestra en la tabla 11:

Los campos de cultivo de Piura e Ica cumplen con lo establecido por la Unión Europea del no uso de los carbamatos, ya que son fundos que exportan sus productos hacia Europa; sin embargo, en los campos de cultivo como de la papa en Huancayo todavía se usa el carbamato como el carbofurano, el cual es altamente tóxico, y como se aprecia en la tabla 11, el carbofurano genera su metabolito como el carbofurano-3-hidroxi, que se encuentra presente en estos suelos, la confirmación de estos analitos son debido a los iones ratio como el carbofurano, que tiene un ion ratio de 10,01 y un tiempo de retención de 4,94 min, , el carbofurano-3-hidroxi, que tiene un ion ratio de 540,1 y un tiempo de retención de 3,20 min, y los analitos en las muestras están en el rango permitido del 70-130% tal como lo indica la guía SANTE, los productos como la papa proveniente de la ciudad de Huancayo, son para distribución nacional.

CONCLUSIONES

Se validó un método analítico alternativo para identificar y cuantificar carbamatos tales como Aldicarb, Carbofurano y sus metabolitos por cromatografía líquida acoplado a un espectrómetro masas triple cuadrupolo (UHPLC/MS/MS).

Los parámetros de validación del método analítico, demostraron la selectividad, debido a la eliminación del efecto matriz, y bajar las interferencias. Es lineal en concentraciones de 5, 10, 50, 100 y 200 ug/L, con un coeficiente de correlación de >0,99. La exactitud se evaluó con la precisión, con las pruebas estadísticas, obteniendo que los datos son precisos, al tener los valores-p de la prueba de ANOVA y Barlett mayores a 0.05, tal como se muestra en las tablas 4 y 5, la exactitud después se evaluó con la veracidad la cual demuestra que los datos obtenidos están dentro del rango de 70-120% de recuperación, también ver que los diferentes analitos, tienen sensibilidades diferentes siendo el aldicarb el analito menos sensible, y el carbofurano el analito más sensible, esto es debido a las pendientes mostradas en la tabla 9. El método propuesto puede cuantificar estos carbamatos en muestras de suelos a partir de 5 ug/L.