Aislamiento de metabolitos

Extracción. -A partir de 150 g de liquen seco y molido, se sónico con aproximadamente 700 mL de MeOH grado analítico, a 25°C durante 30 minutos, se filtró y se reservó el filtrado, se adición 500 mL de MeOH sobre la muestra y se repitió el procedimiento unas 4 veces más. Los extractos combinados de MeOH se concentraron a sequedad con un rotavapor a 40°C (llamado Extracto EM)¹²

Figura 1 Separación del extracto metanólico. 

Separación y purificación. - La separación de los metabolitos secundarios, provenientes del extracto EM (1,9 g), se realizó usando las diferentes técnicas cromatográficas (CC y CCD), en varias etapas tal como lo podemos observar en la Figura 1, se empezó con la columna cromatográfica de exclusión molecular, Sephadex LH-20, con dimensiones acorde con la masa de la fracción y fase móvil de acuerdo a las necesidades, al final se obtuvo un sólido puro después de aplicar su análisis de CCD, este sólido se le llamó DB-HC-01. Luego, a partir de la subfracción S2, tal como se muestra en la Figura 2, se realizó otra CC, utilizando Sílica gel como fase estacionaria, a una proporción 1:40 (g extracto: g sílica) en medio de 400 mL de Hexano¹², después de varios análisis cromatográficos se encontró un sólido puro denominado DB-HC-02.

Figura 2 Separación de la fracción S2 

Dónde: S2: Subfracción 2, F1: Subfracción 1 de la cuarta columna, F2: Subfracción 2 de la cuarta columna.

Figura 3 Separación de la fracción S3. 

Dónde: S3: Subfracción 3, P1: Precipitado 1, F3: Subfracción 3 de la quinta columna, F4: Subfracción 4 de la quinta columna

Por otro lado, se realizó una columna de sílica gel de la subfracción S3, utilizando sílica gel como fase estacionaria, a una proporción 1:40 (g extracto: g sílica) en medio de 400 mL de DCM. Luego, se procedió a realizar una placa en fase reversa MeOH-H₂O (1:1), se observó un compuesto puro, el sólido fue llamado DB-HC-03.

Los sólidos DB-HC-01, DB-HC-02 Y DB-HC-03 que se obtuvieron de las diferentes fases del proceso tuvieron que ser acondicionados previamente para ser enviados al análisis espectroscópico, para ello en un vial se pesó una pequeña parte (<50 mg) del componente separado y purificado de la muestra liquénica, se añadió 5 mL de solvente en el cual será evaluado, luego se empleó el rotavapor para secarlo durante 4 o 6 horas. Una vez seco se diluye con 2 mL del solvente deuterado, con el cual será evaluado, se coloca 0,5 mL de la sustancia preparada con ayuda de una jeringa en un tubo de RMN para ser posteriormente evaluado en el equipo.

Elucidación estructural de metabolitos secundarios

Elucidación estructural del compuesto DB-HC-01.- El compuesto DB-HC-01, es un sólido de color marrón claro, que presentaba solubilidad en cloroformo, acetona. Para el análisis por RMN ¹H se disolvió en CDCl₃, medido a una frecuencia de 400 MHz. en el Espectrómetro de Bruker Avance. En la Figura 5 se observa el espectro de RMN ¹H del compuesto DB-HC-01, que presenta los siguientes datos: A campo alto (desplazamiento menor) se pueden identificar los protones del grupo con menor desprotección, el cual es grupo metilo (-CH₃) como singulete a 0,865 ppm que se encuentra en el rango normal ya que está muy apantallado por la larga cadena de metilenos a la que se encuentra unido. La cadena de metilenos, muestra una señal de singulete a 1,231 ppm, esta señal muestra una gran intensidad debido a la cantidad de protones que representa [22H, (CH₂)₁₁ ^-]; el metileno unido a la cadena y al heterociclo (representado en la Figura 7 con el número 7) presenta una señal de 1,606 ppm, la cual se encuentra ligeramente desplazado de lo normal debido a que se encuentra unido a un heterociclo. De manera inversa el desplazamiento mayor se muestra a campos bajos y corresponde al que está unido heterociclo, el grupo metilideno (=CH₂), con su señal mostrado por dos dobletes a 6,403 y a 5,973 ppm, siguiendo en este orden decreciente se muestra la señal de un cuadruplete a 4,772 ppm, que representa al protón unido al carbono 4 que posee mayor desprotección debido a la cercanía del oxígeno del heterociclo.

Figura 5 Espectro RMN ¹H del compuesto DB-HC-01 en CDCl3 a 400 MHz. 

Por último, la señal del protón del carbono 3 se muestra como un quintuplete a 3.561 ppm, este desplazamiento es debido a que el protón se encuentra en un entorno que presenta una alta densidad electrónica. En la Tabla 2, se toma en cuenta los datos experimentales del ¹H RMN y se comparan con los datos teóricos del Ácido Protoliquesterínico obtenidos por Huneck & Yoshimura¹³ y Kumar et al.¹⁴ de lo cual se observan valores muy cercanos a los obtenidos experimentalmente, con lo cual podemos afirmar que el compuesto DB-HC-01 se trataría del Ácido Protoliquesterínico, cuya estructura química lo observamos en la Figura 6.

Figura 6 Estructura química propuesta para el compuesto DB-HC-01. 

Elucidación estructural del compuesto DB-HC-02.- El compuesto DB-HC-02, es un sólido de color amarillo oscuro, que presenta solubilidad con el cloroformo. En la Figura 7 se muestra el espectro del compuesto del análisis por RMN ¹H que se disolvió en CDCl₃, analizando el espectro observamos que el compuesto pertenece al grupo de los esteroles, ya que presenta los siguientes datos: A desplazamiento menor (campo alto) se pueden identificar seis señales de los protones del grupo metilo (-CH₃) con menor desprotección (cuatro del grupo metilo secundario y dos del grupo metilo terciario). Tal como se observa en la Figura 8, ampliación del espectro, para los grupos metilos secundarios las señales son dobletes, los cuales se muestran a 0,796; 0,836; 0,901 y 0,980 ppm, de manera similar los grupos metilo terciarios muestran señales de singuletes a 0,822 y 0,883 ppm.

Figura 7 Espectro RMN ¹H del compuesto DB-HC-02 en CDCl3 a 400 MHz. 

Figura 8 Ampliación 1 del espectro RMN ¹H del compuesto HC-DB-02. 

Si continuamos escalando a mayores desplazamientos, llegamos a campo intermedio, en donde se apreció una señal multiplete, de seis picos, a 3.951 ppm del hidrogeno en C-3, los seis picos son debido a los cinco hidrógenos cercanos al protón, uno de estos hidrogeno unido a un oxigeno el cual genera una menor protección al protón (Ver Figura 9). A campos bajos, es decir a mayor desplazamiento, se observan dos dobletes a 5,131 y 5,176 ppm, estas se encuentran casi juntas, debido al acoplamiento de dos hidrógenos, adicionalmente estas señales nos comprobaron la presencia de hidrógenos vinílicos del compuesto en posición trans.

Por último, tal como se observa en la Figura 10 a campos muy bajos se muestran dos dobletes a 6,212 y 6,474 ppm, estas señales sugirieron ser de hidrógenos que forman un doble enlace, sin embargo, a diferencia de las señales precedentes estas están más desplazadas debido a que se encuentran en una posición muy cercana al radical superóxido lo cual genera un entorno que presenta una alta densidad electrónica, demostrando así la presencia de una estructura de peróxido.

Figura 9 Ampliación 2 del espectro RMN ¹H del compuesto HC-DB-02. 

En la Tabla 3, se toma en cuenta los datos experimentales del ¹H RMN y se comparan con los datos teóricos del Peróxido de Ergosterol obtenidos por Huneck & Yoshimura¹³, Krzyczkowski et al.¹⁵ y Yang et al.¹⁶, de lo cual a través del análisis espectrométrico se observan once valores muy cercanos a los correspondientes, con lo cual podemos afirmar que el compuesto HC-DB-02 se trataría del Peróxido de Ergosterol, cuya estructura química lo observamos en la Figura 11.

Figura 10 Ampliación 3 del espectro RMN ¹H del compuesto HC-DB-02. 

Elucidación estructural del compuesto DB-HC-03.- El compuesto DB-HC-03, es un sólido de color marrón claro, soluble en acetona, medianamente soluble en metanol y cloroformo. Para el análisis por RMN ¹H se disolvió en CD₃COCD₃, medido a una frecuencia de 400 MHz. En el Espectrómetro de Bruker Avance. En la Figura 12 se observa el espectro de RMN ¹H del compuesto DB-HC-3, que presento los siguientes datos: A campo alto (desplazamiento menor) se pueden identificar los protones del grupo con menor desprotección, el cual es grupo metilo unido al anillo (-CH₃) como singulete a 2,680 ppm que se encuentra un poco desplazado hacia la izquierda de su rango normal, esto debido a su proximidad con el aldehído. El hidroximetil (-CH₂OH) muestra una señal a 4,757 ppm, esta señal muestra un ligero desplazamiento debido los grupos alcoholes adyacentes; el protón unido al benceno presenta una señal de singulete a 6,688 ppm, la cual se encuentra dentro del rango normal. De manera inversa el desplazamiento mayor se muestra a campos bajos y corresponde al grupo aldehído, (-CHO), con su señal mostrado por un singulete a 10,420 ppm, que posee mayor desprotección debido al doble enlace con el oxígeno y debido a que el protón se encuentra en un entorno que presenta una alta densidad electrónica.

Figura 11 Estructura química propuesta para el compuesto DB-HC-02. 

En la Tabla 4, se toma en cuenta los datos experimentales del ¹H RMN, los cuales se comparan con los datos teóricos del 2-Hidroxi-4-metoxi-6-metilbenzaldehido y del 2,4- Dihidroxi-6-metilbenzaldehido tomados del Huneck & Yoshimura¹³ y el 2,4-dihidroxi-3- (hidroximetil)-6-metilbenzaldehido tomado de Doyon et al.¹⁷, de lo cual se observan valores teóricos cercanos a los correspondientes experimentales, con lo cual podemos afirmar que el compuesto DB-HC-3 se trataría del 2,4-dihidroxi-3-(hidroximetil)-6- metilbenzaldehido, cuya estructura química lo observamos en la Figura 13.

Figura 12 Espectro RMN ¹H del compuesto DB-HC-03 en CD₃COCD₃ a 400 MHz. 

Figura 13 Estructura química propuesta para el compuesto DB-HC-03.