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INTRODUCCIÓN
El Vaccinium floribundum Kunth conocido como pushgay, mortiño o arándano andino, pertenece a la familia Ericaceae, siendo el género Vaccinium el más representativo. Se distribuye en América del Sur, principalmente Perú, Ecuador, Colombia y Venezuela, en altitudes entre 1800 a 3800 m.s.n.m. El fruto es una baya esférica de 0,5 a 0,8 cm de diámetro de color azul a azul oscuro de textura lisa y con sabor dulce 1. El consumo de este fruto proporciona antioxidantes exógenos y disminuye el riesgo de enfermedades cerebrovasculares 2 .
La mayoría de los compuestos bioactivos de esta planta, se encuentran en el fruto, siendo los flavonoides y ácidos fenólicos los resaltantes pertenecientes al grupo de los fenoles 1, los cuales presentan propiedades antioxidantes por su alta capacidad de neutralizar especies radicalarias 3. Últimas investigaciones evidencian que los radicales libres y las especies reactivas intervienen en las reacciones celulares de nuestro organismo causando daños oxidativos, sin embargo, una dieta rica en vitaminas y compuestos fenólicos previenen reacciones que pueden generar especies más nocivas 4.
Por lo que existe una tendencia para investigar las propiedades beneficiosas del Vaccinium floribundum Kunth. En el Perú, se puede ubicar de forma silvestre al pushgay en las provincias de Chota, Cajabamba, Celendín, Hualgayoc y San Marcos, pertenecientes a la región de Cajamarca. Los pobladores lo consumen directamente como fruta fresca o en productos procesados como mermeladas, helados, jugos y vinos, por otra parte; ciertas comunidades nativas de la región lo utilizan de manera tradicional en forma de extracto para aliviar enfermedades como la diabetes e inflamaciones 5; no obstante ante la carencia de información científica que validen su utilización en nuestro país, nos planteamos los objetivos de determinar los parámetros fisicoquímicos, capacidad antioxidante in vitro y caracterización fitoquímica del extracto hidroalcohólico del Vaccinium floribundum Kunth que impulsaría su cultivo y consumo para la salud humana.
PARTE EXPERIMENTAL
Material Vegetal
Se utilizó el fruto (baya) del Vaccinium floribundum Kunth proveniente de la provincia de San Marcos de la región de Cajamarca. La recolección y clasificación taxonómica fue realizada por el taxónomo José Ricardo Campos de la Cruz.
Preparación del extracto hidroalcohólico
Se seleccionó los frutos sanos y enteros, libres de hongos y sin golpes, se procedió a lavar con abundante agua y se congeló la muestra a -18 °C para su almacenamiento. Posteriormente se sometieron a un proceso de liofilización (para evitar la degradación de compuestos termolábiles) a una temperatura de - 40°C y 900 mmHg de presión, finalmente se obtuvo un polvo seco deshidratado. El polvo seco deshidratado fue macerado durante 3 días en una solución hidroalcohólica a diferentes concentraciones 50
%, 70 % y 96 %, finalizado el proceso se filtró para obtener el extracto y se almacenó en un frasco ámbar en refrigeración para su posterior uso 6.
Tamizaje fitoquímico
El análisis para la determinación de los diferentes constituyentes químicos del extracto hidroalcohólico del fruto del Vaccinium floribundum Kunth “pushgay” a diferentes concentraciones 50 %, 70 % y 96 % fue realizado mediante ensayos de coloración y precipitación según Lock de Ugaz 7.
Determinación de los parámetros fisicoquímicos
Los parámetros fisicoquímicos analizados fueron densidad relativa, sólidos totales, pH, índice de refracción y grados Brix según los métodos oficiales de la AOAC (2023), por triplicado 8.
Determinación de Fenoles Totales por el método de Folin-Ciocalteu
El contenido de fenoles totales fue realizado según la metodología descrita por Ivanova et al.9, se prepararon diluciones del extracto hidroalcohólicos de diferentes concentraciones del fruto del Vaccinium floribundum Kunth “Pushgay” hasta alcanzar concentraciones de 0,99 µg/mL a 7,92 µg/mL. Posteriormente se añadió 2,5 mL de Folin- Ciocalteu y 2 mL de carbonato de calcio al 7,5 %, los tubos se homogenizaron y se incubaron en baño maría a 45°C por 15 minutos, pasado el tiempo de incubación se enfrió la batería de tubos en un lugar oscuro por 15 minutos. Finalmente se realizaron las lecturas de absorbancias a 760 nm. Conjuntamente, se empleó como patrón de referencia ácido gálico, la curva se preparó con concentraciones de 9,90 µg/mL a 79,20 µg/mL con un valor de R2 igual a 0,9968. El contenido total de fenoles totales fue expresado en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de peso seco (mg GAE/g de extracto) 9 .
Análisis de Actividad Antioxidante
La actividad antioxidante in vitro del extracto hidroalcohólico se determinó por los métodos de DPPH y ABTS.
Método de inhibición frente al radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidraizilo (DPPH)
Se usó el método propuesto por Brand-Williams et al. 10. Se prepararon diluciones del extracto hidroalcohólico de diferentes concentraciones del fruto “pushgay” hasta alcanzar concentraciones de 13,4765 µg/mL a 215,6250 µg/mL. Posteriormente se añadió 1 mL de DPPH disuelto en etanol. Luego de 30 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente se realizaron las lecturas de absorbancias a 517 nm. Conjuntamente, se empleó como patrón de referencia trolox, la curva se preparó con concentraciones de 1,25 µg/mL a 6,25 µg/mL con un valor de R2 igual a 0,9957. Los resultados se expresaron en capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC-DPPH) y concentración inhibitoria media (IC50) (μg de muestra seca/mL) 10.
Método de decoloración con el radical catiónico 2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolin 6- sulfónico) (ABTS*+)
Según Roberta et al.11. Se prepararon diluciones del extracto hidroalcohólico de diferentes concentraciones del fruto del Vaccinium floribundum Kunth “pushgay” hasta alcanzar concentraciones de 0,0808 µg/mL a 1,2937µg/mL. Posteriormente se añadió 1,5 mL de ABTS disuelto. Luego de 30 minutos en oscuridad y a temperatura ambiente se realizaron las lecturas de absorbancias a 734 nm. Conjuntamente, se empleó como patrón de referencia trolox, la curva se preparó con concentraciones de 0,625 µg/mL a 5 µg/mL con un valor de R2 igual a 0,9983. Los resultados se expresaron en capacidad antioxidante equivalente a trolox (TEAC-ABTS) y concentración inhibitoria media (IC50) (μg de muestra seca/mL) 11.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los parámetros evaluados como control de calidad de la fruta fueron la densidad relativa, sólidos totales, índice de refracción, grados brix y el pH (Tabla 1). La densidad relativa de los extractos hidroalcohólicos a diferentes concentraciones es ligeramente inferior a la densidad del agua (0,829-0,948 g/mL). El pH de los tres extractos está en un rango ácido, presentando mayor acidez el extracto al 50 %. Estos resultados de pH son similares al reportado para V. floribundum proveniente de los andes ecuatorianos (pH 3,20). La acidez se debe a los ácidos orgánicos, principalmente al ácido cítrico, presente en la fruta 12. Finalmente, los datos reportados favorecen al incremento de información sobre el berry nativo pushgay proveniente de la región Cajamarca, cabe resaltar que estos parámetros fisicoquímicos pueden ser diferentes entre especies y variedades por influencia de las condiciones ambientales y su adaptación agronómica 13. Las características organolépticas de los extractos presentaron un color rojo violáceo, olor característico y aspecto líquido. El porcentaje de rendimiento del liofilizado de los frutos del pushgay fue 36,71%, esto puede deberse al contenido de humedad presentado en la baya con 83% 6.
Tabla 1 Resultados de los parámetros fisicoquímicos del extracto hidroalcohólicos al 50
| Extracto del fruto pushgay | DR (1) | ST (2) | IR (3) | °BX (4) | pH |
| Extracto 50 % | 0,948 ± 0,00 | 0,124 ± 0,00 | 1,361 ± 0,00 | 18,00 ± 0,00 | 3.397 ± 0,01 |
| Extracto 70 % | 0,906 ± 0,00 | 0,119 ± 0,00 | 1,366 ± 0,00 | 21,50 ± 0,00 | 4.000 ± 0,00 |
| Extracto 96 % | 0,829 ± 0,00 | 0,094 ± 0,00 | 1,367 ± 0,00 | 22,00 ± 0,00 | 3.980 ± 0,00 |
Valores (promedio ± DS)
Densidad relativa: g/mL a 20,1 °C
Sólidos totales: del extracto mg/mL
Índice de refracción.
Grados Brix: extracto seco disuelto en el solvente a 20,1 °C
La Tabla 2 muestra resultados del tamizaje fitoquímico realizado a los tres extractos hidroalcohólicos del fruto de Vaccinium floribundum Kunth “pushgay”, destacando la presencia de carbohidratos, azúcares reductores, compuestos fenólicos, flavonoides, taninos, compuestos amino y heterósidos en todos los extractos. Investigaciones como las de Cerrato, A et al.14, son semejantes a nuestros resultados, por evidenciar la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides en la baya pushgay 14, los cuales poseen actividades biológicas beneficiosos como la capacidad antioxidante, reducción del estrés oxidativo y daño mitocondrial, además de disminuir los riesgo de ECV por la reducción de la disfunción endotelial 5.
De forma preliminar en el tamizaje fitoquímico se determinó la presencia de flavonoides, estudios realizados por Llerena W. et al.6, reportan la presencia de antocianinas (flavonoides) como responsables de la pigmentación morado - azul oscuro del pushgay 6. Por último, estudios de Nieves Baenas et al.13, confirman la presencia de carbohidratos en la baya nativa pushgay otorgándole el sabor dulce y agradable para su consumo directo 13.
Tabla 2 Tamizaje fitoquímico del extracto hidroalcohólicos al 50 %, 70 % y 96 % del fruto del Vaccinium floribundum Kunth “pushgay”.
| N° | Reactivo | Extracto 50% | Extracto 70% | Extracto 96% | Constituyentes químicos |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Molish | + | + | + | Carbohidratos |
| 2 | Antrona | + | + | + | Carbohidratos |
| 3 | Fehling | + | + | + | Azúcares reductores |
| Compuestos | |||||
| 4 | FeCl3 | + | + | + | fenólicos |
| 5 | Shinoda | + | + | + | Flavonoides |
| 6 | Rosenheim | - | - | - | Catequinas |
| Compuestos | |||||
| 7 | Borntrager | - | - | - | antraquinónicos |
| 8 | Gelatina | + | + | + | Taninos |
| 9 | Liebermann-Burchard | - | - | - | Compuestos triterpenoides |
| 10 | Ninhidrina | + | + | + | Compuestos amino |
| 11 | Dragendorff | - | - | - | Alcaloides |
| 12 | Mayer | - | - | - | Alcaloides |
| 13 | Bertrand | - | - | - | Alcaloides |
| 14 | Sonnenschein | - | - | - | Alcaloides |
| 15 | Ensayo de la espuma | - | - | - | Saponinas |
| 16 | Vainillina sulfúrica | + | + | + | Heterósidos |
Leyenda:
Presencia: +; Ausencia: -
En la Tabla 3, se reporta la capacidad antioxidante de los tres extractos de pushgay a diferentes concentraciones 50 %, 70 % y 96 %. Por el método DPPH se determinó que el extracto hidroalcohólico al 50 % presenta mayor capacidad antioxidante expresado por el menor valor de IC 50 (121,488 ± 0,404 µg/mL) en comparación a los demás extractos. Por el ensayo de ABTS el extracto hidroalcohólico al 96 % presenta mayor capacidad antioxidante expresado por el menor valor de IC 50 (38,874 ± 0,119 µg/mL) en relación con los extractos de 50 % y 70 %.
Con respecto al contenido de fenoles totales (Tabla 3), se realizó una curva patrón para el ensayo de Folin - Ciocalteu correspondiente al ácido gálico con un valor de R2 igual a 0,9968, a partir de la gráfica obtenida de los valores de absorbancia y concentración. El contenido de fenoles totales en los extractos de pushgay a diversas concentraciones 50 %, 70 % y 96 % corresponden a los siguientes valores 38,131 ± 0,242, 34,780 ± 0,145 y 27,510 ± 0,046 (mg EAG/g extracto) respectivamente. Se demostró que el CPT del pushgay proveniente de las zonas de Cajamarca tiene hasta cuatro veces más contenido de fenoles totales en comparación con las bayas provenientes de la región de Ecuador (9,25 mg EAG/g extracto) 15. Reportes de investigaciones como Alarcón-Barrera et al.15, evidenciaron que el contenido de fenoles totales (CPT) en las bayas del pushgay provenientes de las zonas altoandinas de Ecuador contienen 9,25 mg EAG/g extracto siendo mayor en comparación con las fresas, frambuesas y las moras andinas provenientes de la misma región con un valor de 2,66 mg EAG/g extracto15, esto podría deberse que los compuestos fenólicos de una misma especie pueden variar significativamente según el origen geográfico, factores externos como el clima y diferentes métodos de obtención de sus extractos; cabe resaltar que el pushgay (berry nativo) es una fuente natural con alto contenido de compuesto fenólicos y el consumo de estos presentan un gran beneficio natural para la salud por su relevante capacidad antioxidante 13,15.
Investigaciones como las de Cerrato A et al.14, afirman la presencia de varios compuestos polifenólicos como el ácido gálico, los derivados del ácido hidroxibenzoico (ácido vanílico y p-hidrobenzoico), los flavan-3-oles y proantocianidinas (catequina y epicatequina), derivados de flavonol (quercetina y miricetina) y derivados del ácido hidroxicinámico (ácido clorogénico, cafeico, ferúlico y p-cumárico) 14, los cuales presenta una actividad antioxidante neutralizando a las especies oxidantes y las radicalarias, adicionalmente estos compuestos bioactivos mitigan la incidencia de enfermedades crónicas no transmisibles como la diabetes y enfermedades cardiovasculares 16.
El análisis de fenoles totales en los extractos de pushgay presentó capacidad antioxidante. En este ensayo se determinó la concentración de extracto del pushgay necesario para disminuir en un 50% la concentración inicial del radical DPPH, teniendo en consideración que un IC 50 bajo representa una actividad antioxidante alta. Ramos et al.17, reportan criterios para clasificar una capacidad antioxidante, un IC 50 menor a 30 µg/mL presenta un alto potencial antioxidante, un IC 50 entre a 30 µg/mL a 100 µg/mL presenta un moderado potencial antioxidante y un IC 50 superior a 100 µg/mL presenta un bajo potencial antioxidante 17. Como se observa en la Tabla 3, los valores de IC 50 en los tres extractos superan los 100 µg/mL, sin embargo se podría resaltar el extracto al 50% que mostró el menor IC 50 con un valor 121,488 ± 0,404 µg/mL, lo cual indicaría un bajo potencial antioxidante del pushgay, esto podría deberse a la presencia de ciertos compuestos bioactivos susceptibles a la variación de pH, como son las antocianinas, a pH ácidos de 1 a 2 las antocianinas se mantienen en su forma más estable representado por el catión flavilium (color rojizo), a pH débilmente ácidos, neutro y básicos el carbinol las formas de base quinonoidal predominan, por lo que el color rojizo se decolora; entonces se puede decir que un factor clave en la alteración y degradación de las estructuras de las antocianinas es el pH, puesto que en la preparación de los extractos hidroalcohólicos a diferentes concentraciones se debió acidificar con HCl 0.1 M y así mantener las formas más estables de las antocianinas, además de las condiciones frías y en oscuridad 18.
Para el análisis in vitro se recomienda ensayar al menos dos métodos para evidenciar resultados confiables, por lo cual se utilizaron los métodos de DPPH y ABTS para evaluar la capacidad antioxidante. Los extractos del pushgay evaluados por el método ABTS mostraron un IC 50 mejor que el trolox (IC 50 trolox =3,4238 ug/mL), cabe resaltar que el extracto al 96 % presentó un IC 50 ligeramente menor (0,621 ± 0,002 ug/mL) en comparación con los otros extractos, esto puede deberse a que la actividad antioxidante evaluada mediante el método ABTS puede evaluarse en extractos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, caso contrario sucede en el DPPH que solo puede medir la capacidad antioxidante en medios orgánicos; estudios de Kuti et al.19, evidenciaron mayor capacidad antioxidante en extractos etanólicos que acuosos, lo cual es un limitante para la cuantificación de la capacidad antioxidante de los compuestos con una polaridad similar al agua, como sería el caso de las antocianinas, ya que estas son solubles principalmente en solventes con una polaridad elevada. Sin embargo, el potencial antioxidante también se ve influenciado por el tipo de estructura polifenólica de la molécula, específicamente por la estructura de un azúcar glucósido que al estar conjugada con el azúcar posee alta actividad antioxidante debido al -OH unido al anillo A, B o C de una molécula de flavonoides 19.
En las investigaciones de Pio Prencipe et al.20, sobre la capacidad antioxidante por el método ABTS en extractos de las bayas del pushgay provenientes del sur de Quito (Ecuador) evidenciaron valores de IC 50 de 0,339 ug/mL, mostrando similitudes con los ensayos realizados en la presente investigación (Tabla 3), cabe recalcar que el ensayo experimental se realizó en la misma especie Vaccinium floribundum Kunth pero proveniente de la región Cajamarca (Perú) 20.
Finalmente, la capacidad antioxidante de una fruta está relacionada con los efectos sinérgicos de los compuestos fenólicos, Rojas-Campo et al.21, en sus investigaciones muestra valores bajos de CPT (1,91 mg EAG/g extracto), esto debido a que las extracciones de la baya se obtuvieron con agua, caso contrario se observa en los resultados obtenidos, ya que estos fueron elaborados a base de etanol a diferentes concentraciones presentando mayor contenido de compuestos fenólicos (Tabla 3), esto se puede explicarse por la alta polaridad de las antocianinas, principalmente los compuestos fenólicos por la elevada afinidad a solventes polares 21.
Adicionalmente se puede comparar el TEAC de diferentes bayas y frutas para conocer el mejor potencial antioxidante, Rojas-Campo et al.21, en su investigación determina el TEAC por el método ABTS de diversas bayas como es el pushgay ecuatoriano, sauco, mora y aguaymanto con valores de 3,39, 6,57, 6,34 y 1,5 umol trolox/ g extracto seco respectivamente, observando que el pushgay de la región de Cajamarca triplica el valor, lo que refleja grandes diferencias entre genotipos, variedades, desarrollo y etapas de maduración del fruto, además del contenido de compuestos fenólicos, por lo que el Pushgay puede proporcionar una excelente fuente de antioxidantes en la dieta diaria con posibles beneficios para la salud humana 21.
Tabla 3 Resultados del contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante del extracto hidroalcohólico del fruto del Vaccinium floribundum Kunth “pushgay”.
| Extracto del fruto Pushgay | CPT (1) (mg EAG/g extracto) | DPPH | ABTS | DPPH | ABTS | DPPH | ABTS | |
| IC 50 (2) | TEAC (3) | TEAC (4) | ||||||
| Extracto 50 % | 38,131 ± 0,242 | 121,488 ± 0,404 | 0,734 ± 0,002 | 28089,156 ± 147,482 | 4150,452 ± 0,47 | 112,226 ± 0,589 | 16,582 ± 0,049 | |
| Extracto 70 % | 34,780 ± 0,145 | 134,857 ± 0,715 | 0,822 ± 0,001 | 26254,202 ± 107,716 | 3676,016 ± 0,071 | 104,895 ± 0,43 | 14,687 ± 0,034 | |
| Extracto 96 % | 27,510 ± 0,046 | 239,685 ± 0,171 | 0,621 ± 0,002 | 13609,683 ± 21,669 | 4894,558 ± 0,12 | 54,375 ± 0,086 | 19,555 ± 0,059 | |
Valores (medio ± DS)
Contenido de fenoles totales: mg de ácido gálico equivalente (EAG)/g de extracto seco de baya.
Concentración inhibitoria media: μg extracto / mL necesario para reducir al 50 % la concentración inicial del radical DPPH o ABTS.
Capacidad antioxidante equivalente a trolox: μg de trolox/g extracto seco.
Capacidad antioxidante equivalente a trolox: μmol de trolox/g extracto seco.
CONCLUSIONES
Los parámetros fisicoquímicos (densidad relativa, sólidos totales, índice de refracción, grados brix y pH) sirven como herramienta de control de calidad.
La mayor capacidad antioxidante se obtuvo en el extracto del Vaccinium floribundum Kunth “pushgay” al 50% con TEAC de 28089,156 ±147,482 μg de trolox/g extracto seco. En general, nuestros resultados obtenidos proporcionan evidencia sobre la constitución química y capacidad antioxidante del arándano andino silvestre más conocido como pushgay, Vaccinium floribundum Kunth, lo que lo hace potencialmente promisorio por sus altos valores de compuestos fenólicos.
