Colecta y tratamiento de las muestras

Las hojas de Juglans neotropica Diels fueron adquiridas en el distrito de Chachapoyas, departamento de Amazonas, Perú. El proceso de recolección tuvo lugar a principios del año 2023. Posteriormente, las hojas se dejaron al aire libre, expuestas directamente a la luz solar, con el fin de llevar a cabo su secado.

Obtención del aceite esencial

El aceite esencial de las hojas de Juglans neotropica Diels se obtuvo utilizando un destilador semi industrial de acero inoxidable que funcionaba con vapor de agua. Cada destilación se llevó a cabo con una cantidad de 6 Kg de material, y en total se procesaron 13 kg de materia vegetal seca. El rendimiento final fue de 0,03 % v/p de aceite esencial de Juglans neotropica Diels.

Determinación de la composición química

La composición química del aceite esencial extraído de las hojas de Juglans neotropica Diels fue analizada mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) utilizando el equipo GC Thermo Finnigan, TRACE-MS Cuadrupolo con el método de inyección líquida. Se empleó una columna capilar RESTEK 5% diphenyl / 95% dimethyl polysiloxane, 30 m x 0,25 mm x 0,25 um a una temperatura inicial de 80 °C. La velocidad de flujo utilizada fue de 1 ml/min, y se utilizó helio como gas de arrastre. Para la identificación de los compuestos químicos volátiles presentes en la muestra, se compararon los tiempos de retención y los datos espectrales con la librería NIST 2014.

Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método de captación del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•)

Se desarrolló la metodología propuesta por Blois ⁸, a partir de una solución stock al 40 % de 2,2-Difenil-1-Picril Hidrazilo se preparó una solución de trabajo en el rango de 0,6 a 0,7 de absorbancia. Este radical cromóforo de color violeta es estable, y cuando es reducido a hidracina se decolora a amarillo pálido a una longitud de onda de 517 nm. Este radical diluido se enfrentó con las concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 ul/ml de aceite esencial Juglans neotropica Diels.

Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método de captación del radical ácido 2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolin)- 6-sulfónico (ABTS•+)

Se desarrolló la metodología de Re ⁹, la cual utiliza al radical catiónico ABTS^•+, 2,2’-azinobis (3-ácido etilbenzotiazolina-6-sulfónico), cromóforo azul-verdoso, que es inhibido a una longitud de onda de 734 nm por compuestos antioxidantes. Se preparó una solución de trabajo a partir de 3,92 mg/ml del radical ABTS^•+ hasta llegar al rango de 0,680 - 0,720 de absorbancia. Este radical diluido se enfrentó con las concentraciones de 10, 20, 30, 40 y 50 ul/ml de aceite esencial Juglans neotropica Diels.

Determinación de la actividad anti-Candida albicans

Se realizó una prueba de microdilución cuantitativa de la muestra del aceite esencial de Juglans neotropica Diels, para determinar la menor concentración capaz de inhibir el crecimiento de Candida albicans siguiendo los protocolos modificados de ^{Liu et al. en 2007 10}. Se diluyó el aceite esencial en DMSO, adaptando el esquema de diluciones de drogas insolubles en agua de los protocolos CLSI M27-A2 ¹¹ en un rango de 0,078125 y 40 ul/ml. Se usó como antifúngico de referencia al ketoconazol en concentraciones entre 0.0313 y 16 ug/ml. La cepa de Candida albicans fue inoculada en agar dextrosa Sabouraud a 37°C, para luego diluir en solución salina al 0,85% hasta obtener 1,5 x 10⁶ UFC/ml. Se usó microplacas de 96 pocillos, en cada pocillo se colocó 100 ul de la muestra o referencia y 100 ul de inóculo con indicador de resazurina 20 mg/ml y se realizó la lectura 24 horas después a una incubación de 37°C.

Determinación de la composición química

El análisis cromatográfico de gases acoplado a espectrometría de masa reveló la presencia de diversos compuestos de interés como lo es el fitol, α-pineno, copaeno, α-caryophyllene, Germacrene D, entre otros. Cada compuesto presentó un tiempo de retención característico que se puede apreciar en la Tabla 1.

La composición química del aceite esencial de hojas de Juglans neotropica Diels destaca la presencia de α-pineno, α-caryophyllene y D-limoneno, los cuales son característicos en el género Juglans^12,13, además, se encontró la presencia de α-Muuralene, ɣ-Muuralene y Germacrene D compuestos sesquiterpénicos estudiados gracias a su potencial antimicrobiano y antifúngico ¹⁴.

Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método de captación del radical 2,2-difenil-1-picrihidrazil (DPPH•)

El aceite esencial de hojas de Juglans neotropica Diels exhibió una actividad antioxidante alta según el método DPPH• en un rango de 10 y 50 ul/ml con un porcentaje de inhibición de radicales libres del 14,26% y 48,18% respectivamente como se puede apreciar en la Tabla 2.

La actividad antioxidante de los radicales libres depende de la estructura química y de la cantidad de los componentes químicos que poseen los aceites esenciales, uno de ellos son los compuestos dadores de hidrógeno y electrones ¹⁵. Uno de los componentes identificados por el análisis GC/MS, es el fitol, un diterpeno de los alcoholes cíclicos insaturados, que por la presencia de un doble enlace no conjugado no es un excelente dador de electrones, no obstante, es considerado un precursor de filoquinonas y tocoferoles los cuales son compuestos con gran capacidad antioxidante ¹⁶, además, el grupo hidroxilo del fitol podría estabilizar algunos radicales libres ¹⁷. Algunos autores sugieren que el fitol en un medio lipofílico puede tener acción más inhibidora ¹⁸, una característica de los aceites esenciales es que la mayoría son solubles en alcoholes.

El copano ha sido un componente químico de otros aceites esenciales, los cuales han presentado en los métodos in vitro actividad antioxidante distantes a la de los estándares como el trolox y ácido ascórbico ⁽¹⁹. En un aislamiento de α-pineno ha presentado un valor de IC50 = 310 ug/ml en el método DPPH• ²⁰, lo cual indicaría y le estaría otorgando al aceite esencial un poder antioxidante muy inferior al estándar Trolox. En otras investigación el trolox ha presentado ABTS y DPPH inhibición del radical, tres veces mejor que el D-limoneno ha presentado en el método ²¹.

Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método de captación del radical acido 2,2’-azinobis (3-etilbezotiazolin)- 6-sulfonico (ABTS•+)

El aceite esencial de hojas de Juglans neotropica Diels exhibió una actividad antioxidante alta según el método ABTS•+ en un rango de 10 y 50 ul/ml con un porcentaje de inhibición de radicales libres del 22,50% y 63,03% respectivamente como se puede apreciar en la Tabla 3.

Los IC50 obtenidos fueron de 52,25 ul/ml y 34,65 ul/ml de aceite esencial Juglans neotropica Diels en los métodos DPPH• y ABTS•+, respectivamente. El estándar trolox presentó IC50 de 2,0219 x 10^-3 ul/ml en el método DPPH• y 2,649 x 10^-3 ul/ml en ABTS•+, lo cual indica que el aceite esencial de Juglans neotropica Diels si posee actividad antioxidante pero muy inferior al estándar. Los resultados de la presente investigación en ambos métodos muestra mejor inhibición del radical ABTS•+, este radical tiene mayor afinidad en los medios de reacción hidrofílicos y lipofílico, a diferencia del DPPH• caracterizado por el medio lipofílico ²². Es importante resaltar que los compuestos bioactivos en conjunto pueden presentar acción sinérgica o antagónica, lo cual influye en la actividad inhibitoria de radicales libres ²³.

Determinación de la actividad anti-Candida albicans

El aceite esencial de hojas de Juglans neotropica Diels exhibió una concentración mínima inhibitoria (CMI) de > 40 ul/ml a las 24 y 48 horas según la Tabla 4 por lo que no se considera que tenga una actividad anti-Candida albicans en las concentraciones ensayadas.

El aceite esencial de las hojas de Juglans neotropica Diels presentó un CMI de > 40 ul/ml a las 24 y 48 horas. por lo que se concluye que no tiene actividad anti-Candida albicans en las concentraciones ensayadas. El control ketoconazol también disminuyó su valor de CMI de 2 a 8 ul/ml, lo cual denota una actividad fungistática y no fungicida. Autores como Omar et al. (2001) estudiaron en Colombia la corteza de 14 árboles usados tradicionalmente para tratar infecciones cutáneas en búsqueda de nuevos antifúngicos, el extracto de corteza de árbol de Juglans neotropica Diels presentó una actividad anti-Candida albicans mínima, mientras que el extracto de corteza de árbol de Juglans cinerea tuvo el espectro más amplio de actividades contra Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus fumigatus de una magnitud más considerable ²⁴. Reynaldo et al. (2021) realizaron un estudio sobre la actividad antimicrobiana del aceite esencial de hojas de Juglans neotropica Diels en Perú, determinaron un baja actividades contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus, sin embargo, se deduce que la poca actividad que presenta es gracias a los hidrocarburos monoterpénicos, sesquiterpénicos y sus derivados oxigenados como el D-limoneno ²⁵. Otros estudios afirman la baja actividad del aceite esencial de hojas del género Juglans frente a Staphylococcus epidermidis (15,62 ug/ml), Pseudomonas aeruginosa (31,25 ug/ml) y Staphylococcus aureus (15,62 ug/ml) y Candida albicans (> 40 ul/ml)^26,27.