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Scientia Agropecuaria

versión impresa ISSN 2077-9917

Scientia Agropecuaria vol.7 no.spe Trujillo oct. 2016

http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2016.03.13 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Expresión de β-1,3-Glucanasas de Beauveria bassiana en cultivo con extracto de los fitopatógenos Peronospora variabilis y Fusarium oxysporum

β-1,3-glucanases expression of Beauveria bassiana in culture with extract of the phytopathogenic Peronospora variabilis and Fusarium oxysporum

 

W. Jhoel Montoya Espinoza*; Oscar P. Nolasco Cárdenas; Rosalyn K. Acuña Payano; Ana I. F. Gutiérrez

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática , Universidad Nacional Federico Villarreal, Jr. Río Chepen No. 110, 114 y 290, El Agustino, Lima, Perú.


Resumen

El hongo Beauveria bassiana Vuill. es muy conocido por su capacidad entomopatógena, pero también existe referencias de ser un hongo antagonista, una de las posibles formas de su antagonismo es la antibiosis debido a la presencia de enzimas hidrolíticas en su genoma. Las principales enzimas expresadas contra fitopatógenos son las β-1,3-glucanasas, ya que la pared celular de los fitopatógenos como hongos y oomycetes está constituida en su mayoría por polímeros de β-1,3-glucanos. Se evaluó por qPCR la expresión de dos genes, el gen exo-beta-1,3-glucanasa [XM_008597142.1] y el gen de glucósido hidrolasa familia 55 [XP_008597332.1] de B. bassiana en los días 0, 4 y 7, frente a medios líquidos con distintas fuentes de carbono, laminarina 0,1%, pulverizado de F. oxysporum 0,1% y pulverizado de hojas infestadas con P. variabilis 0,1%. Entre los genes analizados se encontró el ratio más alto en los medios con F. oxysporum para el gen glucósido hidrolasa familia 55 (GH55), los medios con P. variabilis no tuvieron una expresión significativa. Nosotros postulamos que el aumento de la expresión del gen glucósido hidrolasa familia 55 (GH55), en el día 4, en medios con F. oxysporum podría ser importante en el metabolismo de B. bassiana frente a este sustratos.

Palabras clave: Beauveria bassiana, exo-β-1,3-glucanasas, fitopatógenos, expresión relativa.


Abstract

The fungus Beauveria bassiana Vuill. is well known for its ability entomopathogenic but there is also references to be an antagonist fungus, one of the possible ways of their antagonism it is antibiosis as is known the presence of hydrolytic enzymes in their genome. The main enzymes expressed against phytopathogenic are β-1,3-glucanases, since the cell wall of the phytopathogenic like fungi and oomycetes consists mostly polymers of β-1,3 glucans. The expression of exo-1,3-beta glucanase [XM_008597142.1] and glycoside hydrolase family 55 [XP_008597332.1] genes of B. bassiana was evaluated by qPCR at days 0, 4 and 7, against liquid culture mediums with different carbon sources, 0.1% laminarin, 0.1% pulverized of F. oxysporum and 0.1% pulverized of leaves infested with P. variabilis. Among the genes analyzed the highest rate was found in the cultures with F. oxysporum to the glycoside hydrolase family 55 (GH55) gene, cultures with P. variabilis did not have a significant expression. We postulate that the increased expression of the glycoside hydrolase family 55 (GH55) gene, at day 4, media with F. oxysporum may be important in the metabolism of B. bassiana against this substrate.

Keywords: Beauveria bassiana, exo-β-1,3-glucanase, plant pathogens, relative expression.


1. Introducción

En la actualidad Beauveria bassiana es conocido como un microorganismo de doble control biológico, atacando tanto a plagas de insecto como a fitopatógenos, y sumándole a esto su amplia distribución mundial, hacen de este microorganismo uno de los referentes más importantes para el control biológico (Ownley et al., 2008; Vega et al., 2009).

El antagonismo de B. bassiana ha sido definido en los últimos años demos- trándose la inhibición de enfermedades de plantas causadas por fitopatógenos de origen de suelo como Rhizoctonia solani (Lartey y Caesar, 2004) y Pythium myriotylum (Clark, 2006). Se ha sugerido la competencia por espacio, el microparasitismo y resistencia inducida como posibles formas de antagonismo (Griffin, 2007; Ownley et al., 2008); sin embargo los resultados varían con los distintos fitopatógenos.

También ha sido sugerido la antibiosis como modo de antagonismo de B. bassiana, ya que se ha podido aislar meta- bolitos secundarios como beauvericina (Leckie et al., 2008) y oosporeina en investigaciones similares a las ya mencionas, pero no se sabe si estos compuestos juegan un papel en la supresión de enfermedades de las plantas; de igual forma las enzimas son una de las principales moléculas utilizadas en este mecanismo, estas pueden hidrolizar la pared celular del fitopatógeno evitando su normal crecimiento y permitiéndole la introducción de sustancias tóxicas causán- dole la muerte (Aceves et al., 2005; Ownley et al., 2010).

Los β-1,3-glucanos son polisacáridos que constituye una gran variedad de paredes celulares como la de los hongos filamentosos y Oomycetes (Bowman y Free, 2006; Bacic et al., 2009), muchos de estos microorganismos son fitopatógenos, como Fusarium oxysporum y Peronospora variabilis responsables de grandes pérdidas agrícolas en el mundo, como el cultivo de Chenopodium quinoa que tiene una gran importancia económica en el Perú. Las enzimas capaces de hidrolizar estas estructuras son las β-1,3-glucanasas, las cuales son producidas por una gran variedad de hongos que las utilizan para su desarrollo y en respuesta a las condiciones de agotamiento de fuente de carbono y energía (Pitson et al., 1993; Martin et al., 2007).

Las investigaciones sobre Beauveria bassiana se han centrado generalmente en explicar su mecanismo de acción a nivel de cultivo y a nivel enzimático estudiando la presencia de enzimas o de su actividad a nivel general, sin embargo son muy pocos los genes identificados en su actividad entomopatógena y antagónica. Aunque existe anotaciones de genes de glucanasas en el genoma de B. bassiana no hay referencias de la expresión génica de algún gen β-1,3-glucanasa implicado en su capacidad antagonista.

El objetivo del presente trabajo fue realizar el análisis de la expresión de β-1,3- Glucanasa de Beauveria bassiana en medios líquidos suplementados con distintas fuente de carbono los cuales incluye los fitopatógenos Peronospora variabilis y Fusarium oxysporum y observar variación de la expresión génica.

2. Materiales y métodos

2.1 Lugar de ejecución

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal.

2.2 Métodos de análisis

Medios de cultivo

El hongo Beauveria bassiana (Cod: CCB- LE 262 - SENASA), fue cultivado en agar de papa y dextrosa (PDA) e incubado a 27 ºC por 7 días, el micelio obtenido se traspasó a un medio enriquecido (ME) y se dejó incubar a 28 ºC por 4 días, 130 rpm y una humedad relativa de 60%. En la etapa logarítmica de desarrollo el hongo fue centrifugado a 5000 rpm por 20 min y lavado con medio mínimo (MM). El hongo lavado fue repartido a 6,6 x 107 conidios por mililitro en cada medio.

Los medios de cultivos líquidos fueron preparados teniendo como base un medio mínimo (MM) para el cultivo de hongos entomopatógenos. Para 100 mL de MM se requiere 0,6 g de NaNO3; 0,052 g de KCL; 0,202 g de KH2PO4 y 0,102 g de MgSO4, a esta solución se le agregó 40 µL de elementos trazas formulado según Fernandes et al. (2012). El ME consistió en MM más p/v (extracto de levadura 1%, peptona 1% y glucosa 4%); los otros medios consistieron en MM y como única fuente de carbono (p/v) laminarina 0,1% (ML), pulverizado de Fusarium oxysporum 0,1% (MF), pulverizado de hojas sanas 0,1% (MH) y pulverizado de hojas con P. variabilis 0,1% (MP). Se prepararon 20 mL de medios líquidos en matraces de 50 mL, se incubaron a 28 ºC a 130 rpm y con 63% de humedad relativa.

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

El hongo de cada uno de los medios de cultivo fue lavado con MM y centrifugado a 12000 rpm por 10 minutos, al pellet se le agregó 100 µL de lisozima (10 mg/mL) y se dejó incubar a 37 °C por 15 minutos, después se agregó 100 µL de proteinasa K (2 mg/mL) y se dejó incubar a 52 °C por 15 minutos. Luego se colocó en un mortero, se le agregó nitrógeno líquido y se pulverizó hasta que se redujera a un polvo fino.

La extracción del ARN se realizó con el kit High Pure RNA isolation (Cat. No: 11828665001-Roche) siguiendo las indica- ciones del fabricante. Para mejorar la eliminación de ADN, se agregó 9 µL de tampón de reacción ADNasa y 9 µL de ADNasa I, se homogenizó y dejó incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, luego se agregó 9 µL de solución Stop (50 mM EDTA) y se incubó a 70 °C por 10 minutos. Las muestras de ARN fueron cuantificadas con el fluorómetro Qubit® 2.0, con los kits y protocolos de ensayo Qubit™ ARN y ADNdc BR (Cod: Q32852 y Q32850 - Lifetechnologies).

Para la síntesis de ADNc se utilizó 100 ng de ARN total empleando el kit Maxima First Strand cDNA Synthesis for RT-qPCR (Cod: #K1642 - Thermo Scientific) siguiendo las indicaciones del fabricante mediante la síntesis con cebadores de secuencias al azar.

PCR en tiempo real

El PCR en tiempo real se efectuó con el equipo LightCycler® 96 System mediante el uso del software versión 1.1 y se utilizó el kit FastStart Essential DNA Green Master (Cat. No: 06402712001 - Roche), el cual incluía SYBR Green I como formato de detección. Los cebadores fue- ron diseñados con secuencias registradas en la base de datos del NCBI, estos fueron:

BTOF-GATGGCGACGTACTCGATTGTG, BTOR-AGGTCCCCATAGGAAGGCTCA (XM_008602115.1); ACTF- GCGTACTGGTTCCACGCCTTCTC, ACTR- GGTGGACTGCGACCATTCATCTC (XM_008596211.1); ExoGF- CAACTTTCAGCAGGACAACAACAC, ExoGR-CATTGTGCGATTGCATCAGACC (XM_008597142.1); GH55F- TGTTGGAATTGCCAGTCGCTACA, GH55R- CGAGGATGATGTCGTTGGTCTG (XP_008597332.1).

Para el protocolo de PCR se estableció 40 ciclos, denaturación a 95 °C por 20 s, hibridación 66 °C por 20 s y extensión de 72 °C por 15 s. La secuencia de los productos de amplificación se confirmó por secuenciación estándar en ambas direcciones realizada por la compañía MACROGENE.

Diseño de evaluación

Cada muestra se examinó en tres tiempos, día 0 (día del inóculo), día 4 y día 7; se utilizó el análisis de la cuantificación relativa descrito por Pfaffl (2004). Para analizar la expresión de los genes exo- beta-1,3-glucanasa putativa (ExoG) y glu- cósido hidrolasa familia 55 (GH55), se utilizaron como genes de referencia alfa- actinina (ACT) y beta-tubulina (TBO). El MM fue utilizado como calibrador para los medios ML y MF, el medio MH se utilizó como calibrador para el medio MP. Se rea- lizaron tres repeticiones para cada una de las muestras y el análisis fue hecho con el paquete estadístico IBM SPSS versión 20.

3. Resultados y discusión

Se observó la expresión relativa de ambos genes desde el día de inoculación obtenién- dose un promedio entre los medios de 1,01 ± 0,05 para GH55 y 0,98 ± 0,02 para ExoG. Muchos trabajos destacan a la laminarina como el mayor inductor de enzimas β-1, 3-glucanasas (Donzelli et al., 2001; Martin et al., 2007; Chatterton y Punja, 2009); sin embargo, también se ha observado una producción baja de β-1, 3- glucanasas en medios con laminarina comparados con sustratos contra las que no tiene actividad enzimática y con la pared celular de otros hongos (De La Cruz et al., 1995; Pitson et al., 1997; El-Katatny et al., 2000; McDougall y Seviour, 2005), nuestros resultados guardan relación con los últimos trabajos mencionados, obser- vándose la menor expresión de ambos genes en el ML comparado con los otros medios de cultivo. Los genes en el MP tienen expresiones diferentes, el gen GH55 disminuye su expresión, mientras que el gen ExoG se mantiene estable con un expresión de 1,10 ± 0,06 y 1,16 ± 0,04 veces más que en el MH en el cuarto y sép- timo día, respectivamente (Fig. 1A y B).

Existe evidencia de que la pared celular de fitopatógenos induce la expresión de enzimas como la β-1,3-glucanasas en ensayos de laboratorio, como la β-1,3- glucanasa Glu1 de Clonostachys rosea y exo-β-1,3-glucanasa de Trichoderma asperellum tag83 (Chatterton y Punja, 2009; Marcello et al., 2010) por mencionar algunos; sin embargo, muchos de estos trabajos no analizan la expresión en base a un medio calibrador u olvidan el factor tiempo en ensayos de medio sólido arrojando en algunos casos resultados altos. Nuestros resultados resaltan un aumento en la expresión del gen GH55 inducida por el pulverizado de F. oxysporum, con 1,67 ± 0,09 y 1,18 ± 0,06 veces más que en el MM para el cuarto y séptimo día respectivamente (Fig. 1A y B), este ligero aumento es coherente con los resultados de Giczey et al. (2001) que observaron la expresión de la exo-β-1, 3- glucanasa cmg1 de Coniothyrium minitans frente a sclerotial parasitism; sin embargo ninguno de los trabajos mencionados utilizan el método de cuantificación de Pfaffl limitando así las comparaciones.

Muchos hongos producen múltiples β-1,3- glucanasas extracelulares, de 3 o más isoenzimas siendo algunas enzimas consti- tutivas y otras expresadas según el sustrato, teniendo cada una de estas enzimas diferente modos de acción (De La Cruz et al., 1995; Martin et al., 2006), esto destaca el hecho de una posible acción cooperativa y la baja expresión de algunas de estas enzimas frente a determinados sustratos, por lo cual es necesario identificar y observar cuál de las iso- enzimas tiene una expresión preferencial a su sustrato específico.

4. Conclusiones

La expresión relativa de los ExoG y GH55 de B. bassiana en el medio con laminarina disminuye en el cuarto y séptimo día, mientras el aumento de la expresión del gen GH55 en el medio con F. oxysporum sugeriría que este gen participa en el metabolismo del hongo en medios de cultivo con fuentes limitadas de carbono.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Produc- tividad (PNICP) y al Laboratorio de Bio- química y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad Nacional Federico Villarreal por el Convenio N°189-FINCyT-IB-2013.

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Received May 20, 2016.

Accepted July 19, 2016.