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Scientia Agropecuaria

versión impresa ISSN 2077-9917

Scientia Agropecuaria vol.8 no.4 Trujillo oct./dic. 2017

http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2017.04.05 

ARTÍCULOS ORIGINALES

PCR en tiempo real para el sexaje y análisis citológico de la sinapsis del bivalente más pequeño en espermatocitos en paquiteno de Oreochromis niloticus

Real-time PCR for sexing and cytological analysis of the synapsis of the smallest bivalent in pachytene spermatocytes of Oreochromis niloticus

 

Zulita Prieto*; Monica Arqueros; Linda Sánchez-Tuesta; David Salirrosas

Laboratorio de Genética y Biología Molecular, Universidad Nacional de Trujillo. Av. Juan Pablo II s/n. Ciudad Universitaria, Trujillo, Peru.


Resumen

El objetivo de la presente investigación fue dar a conocer nuevos marcadores moleculares para la PCR en tiempo real asociados a los cromosomas sexuales y el análisis de la sinapsis del bivalente más pequeño en espermatocitos en paquiteno de Oreochromis niloticus. Se diseñaron cuatro pares de cebadores y se pusieron a prueba por PCR punto final y por PCR en tiempo real utilizando el fluorescente SYBR® Green en muestras de ADN de hembras XX, machos XY y supermachos YY. Los tamaños de los fragmentos amplificados por PCR punto final fueron concordantes a los valores esperados y por PCR en tiempo real se demostró igual especificidad pero con ventaja en rapidez en la detección de amplificación de marcadores asociados a los cromosoma X y Y, de acuerdo con las condiciones de la PCR establecidas. Las diferencias genéticas entre las regiones de los cromosomas X y Y demostradas con los marcadores específicos no fueron perceptibles citológicamente en los espermatocitos en paquiteno de O. niloticus XY. En base a las diferencias y homologías de las secuencias de ADN entre las accesiones KC710223 y KC710224 de los cromosomas X y Y se propone un modelo de sinapsis del bivalente XY.

Palabras clave: Oreochromis niloticus; tilapia; PCR en tiempo real; determinación del sexo; paquiteno.


Abstract

The aim of the present study was to report new molecular markers for real-time PCR associated with X and Y sex chromosomes, and perform analysis of the synapsis of the smallest bivalent in pachytene spermatocytes of XY male Oreochromis niloticus. Four pairs of primers were designed and were tested by endpoint PCR and real-time PCR using SYBR Green detection system in DNA samples from XX females, XY males and YY supermales. In order to assess the smallest bivalent synapsis, testicular samples from XY males were used to make chromosomal spreads in pachytene. Size range of fragments amplified by endpoint PCR was concordant with the expected values. Real-time PCR assay showed equal specificity but speed advantage in amplification detection of markers associated with X and Y chromosomes according to the established PCR conditions. Genetic differences between regions of the X and Y chromosomes (smallest bivalent) proven with specific markers were not cytological perceptible in pachytene spermatocytes from XY O. niloticus. A model of XY bivalent synapse was suggested based on the DNA sequences homologies and differences between KC710223 and KC710224 accessions from X and Y chromosomes.

Keywords: Oreochromis niloticus; tilapia; real-time PCR; sex determination; pachytene.


Introducción

Oreochromis niloticus presenta el número diploide 2n=44 de cromosomas (Supiwong et al., 2013) al igual que otras especies del género Oreochromis (Feldberg et al., 2003) y los cromosomas sexuales no presentan dimorfismo cromosómico (Oliveira y Wright 1998). Sin embargo, el sexo fenotípico diferenciado de los adultos y las proporciones de machos y hembras en las progenies de los cruzamientos intraespecíficos constituyen evidencias de las diferencias genéticas entre ambos sexos. Para O. niloticus se reporta el digametismo masculino, sistema XY (Jalabert et al., 1971; Lee et al., 2003), contrariamente, para O. aureus el sistema propuesto es el digametismo femenino, sistema WZ (Avtalion y Don 1990; Cnaani 2013). El sistema de determinación del sexo en el género Oreochromis no está totalmente esclarecido.

Mair et al. (1991) propusieron el sistema monofactorial como mecanismo de determinación sexual en O. niloticus, sustentado en los estudios de distribución de frecuencias del ratio del sexo masculino y femenino evaluado en progenies de cruzamientos de machos YY, XY con hembras XX, progenies ginogénicas y manipulación de genomas por shock térmico. Por otra parte, Ser et al. (2009) sostienen el sistema multifactorial, con un conjunto de loci determinantes del sexo fenotípico para los cíclidos en general.

Los genes determinantes del sexo genético en O. niloticus tendrían su ubicación en los cromosomas sexuales y en un conjunto de genes autosómicos encargados de la morfogénesis gonadal, fisiológica y de comportamiento relacionados con el sexo masculino o femenino. A esto se sumaría el cambio de expresión de los genes determinantes del sexo en la primera etapa de diferenciación gonadal por efectos físicos o químicos, lo que da lugar a neohembras (∆XY) o neomachos (∆XX), cambios conocidos como reversión sexual (Abucay et al., 1999).

Lee et al. (2003) evaluaron tres microsatélites, GM201, UNH995 y UNH104, que segregaron con los cromosomas sexuales y que estarían localizados próximos a los determinantes del sexo, en la región de ligamiento 1 (LG1).Mediante investigaciones de secuenciamiento y pruebas de hibridación in situ demostraron la existencia de un grupo de ligamiento identificado como LG1 en el par cromosómico más pequeño implicado en la determinación del sexo XY en O. niloticus y de un grupo de ligamiento LG3 localizado en el par cromosómico de mayor tamaño, región donde se localizarían los genes del sistema WZ en O. aureus (Cnaani et al., 2008). Palaiokostas et al., 2013 reportaron dos marcadores, Oni28137 y Oni23063, fuertemente asociados con el sexo fenotípico y establecieron que la región determinante del sexo abarca una distancia de 2 cM, que equivale aproximadamente a 1,2 Mb del LG1 en O. niloticus.

Recientemente, Sun et al. (2014) propusieron los marcadores SCARX y SCARY asociados a los cromosomas sexuales X y Y, respectivamente, y mediante pruebas de hibridación in situ localizaron a los marcadores SCAR en el grupo de ligamiento LG23, ubicado en el par cromosómico de menor tamaño del complemento cromosómico, concordante con lo reportado por Eshel et al. (2011, 2012). Habría dos grupos de ligamiento asociados a la determinación del sexo genético, el LG1 y el LG23 en O. niloticus.

Los estudios sobre la homología en los bivalentes en paquiteno de espermatocitos de O. niloticus XY refieren la asinapsis en la región terminal del bivalente 1 de mayor tamaño, con una frecuencia de 25,7% y sugieren que los cromosomas sexuales serían el par cromosómico 1 (Carrasco et al., 1999). Ocalewicz et al. (2009) observaron inconsistencia en la región no apareada en el bivalente, es decir, reportaron al bivalente 1 totalmente apareado y en otros meiocitos al bivalente 1 con una región no apareada, y el mapa físico con los marcadores OniY227 y dmrt4, no corresponden a las distancias de LG3 reportadas por Lee et al. (2005). Según Cnaani et al. (2008) y Lee et al. (2004), el mapa GL3 en la determinación del sexo está asociado a O. aureus y no a O. niloticus. Lee et al. (2011) trazaron mapas genéticos sobre la base de hibridación in situ (FISH) con sondas derivadas de clones con nuevos marcadores y encontraron que los cromosomas determinantes del sexo son los cromosomas más pequeños.

La búsqueda de marcadores moleculares con gran estabilidad asociados a la diferenciación del sexo es necesaria para lograr el control reproductivo.

En este sentido, el objetivo de la presente investigación es proponer nuevos marcadores moleculares para PCR en tiempo real con SYBR Green asociados a los determinantes sexuales de los cromosomas X y Y de O. niloticus para diferenciar supermachos YY de los machos XY, así como en hembras XX y YY. Otro objetivo es mostrar la sinapsis de los bivalentes en espermatocitos en paquiteno de machos YY y de los híbridos XY del cruce de machos YY roja con hembras gris XX de O. niloticus.

2. Materiales y métodos

Material biológico. Se estudiaron individuos supermachos YY, machos XY y hembras XX de Oreochromis niloticus del Centro Experimental de Genética de la Universidad Nacional de Trujillo. Los peces fueron mantenidos de 24 a 26 °C, en condiciones de fotoperiodo natural. Fueron alimentados tres veces al día con alimento extrusado comercial (puritilapia) con 32% de proteína y se hicieron recambios diarios del agua.

Extracción de ADN. Se obtuvieron muestras de la aleta caudal de O. niloticus, de 10 individuos hembra XX, de 10 individuos machos XY y de 10 individuos machos YY, según el procedimiento de Cawthorn et al. (2011). La concentración de ADN genómico se determinó por espectrofotometría con una absorbancia de 260 nm y la pureza de la muestra se determinó con la relación 260/280 nm. El espectrofotómetro utilizado fue modelo Genesys 10Bio UV-Visible Thermo Fisher Scientific.

Amplificación por la PCR punto final. Se usaron los cebadores para los SCAR 5X y SCAR 5Y propuestos por Sun et al. (2014). Las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, 34 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 1 min, SCAR-5F/5R-Y a 53 ºC por 1 min, SCAR-5F-X/5R a 63 ºC por 1 min, extensión a 72 ºC por 1 min y extensión final a 72 ºC por 7 min. Termociclador Veriti 96 marca Applied Biosystems. Los cebadores qPCR-X y qPCR-Y fueron amplificados de acuerdo con las condiciones citadas anteriormente, pero se varió la fase de hibridación, con una Tm de 60 °C para qPCR-X, Tm 60 °C para qPCR-Y, Tm 60 °C para qPCR-I y Tm 57 °C para el control interno β actina. Los productos amplificados fueron evidenciados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñidos con SYBR Safe DNA. La lectura de los geles fue realizada con el equipo documentador de geles ChemiDoc XRS marca Bio-Rad. Los productos amplificados de los marcadores SCAR-5X y SCAR-5Y de muestras de O. niloticus del Centro Experimental de Genética, de la Universidad Nacional de Trujillo, fueron secuenciados y homologados con la base de datos del GenBank (Sun et al., 2014), accesiones KC710223 y KC719224.

Diseño de cebadores para qPCR con SYBR Green. Los cebadores fueron diseñados con el software Primer 3 (software libre) teniendo en cuenta las secuencias de las accesiones antes mencionadas en las versiones KC710223.1 y KC719224.1 y los cebadores del control interno, tomando como base la secuencia del promotor accesión EF026001.1 del GenBank. Los cebadores y amplicones fueron verificados in silico con IDT (Integrated Device Technology) OligoAnalizer.

Amplificación por la PCR en tiempo real (qPCR). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en cada muestra por triplicado en placas de 96 pocillos y termociclador 7500 de Applied Biosystems. Cada par de cebadores fue verificado sin plantilla de ADN para la comprobación de dímeros de cebadores en condiciones experimentales. También se comprobó la determinación de los valores Ct para cada par de cebadores y se analizaron las curvas de disociación de los amplicones generados. La reacción de amplificación fue de 20 µl, constituido por ADN molde 2 µl, 1 µl de cebadores en el master mix de SYBR GreenER qPCR Super Mix Univesal. Las temperaturas y ciclos de amplificación fueron 50 ºC por 2 min, 95 ºC por 10 min, 40 ciclos de 95 ºC por15 s, 60 ºC por 60 s; hubo variación solo en la fase de hibridación, como las indicadas anteriormente en la PCR punto final para cada par de cebadores.

Análisis de datos. Se demostró la eficiencia de la amplificación usando diluciones en serie de muestras de ADN con cada uno de los cebadores y la determinación del ciclo umbral (Ct) en función de la concentración de la muestra. La amplificación del control interno, gen autosómico, fue importante como control de la amplificación por qPCR en todos los individuos supermachos YY, machos XY y hembras XX.

Obtención de cromosomas en metafase. Se inyectó colchicina 0,05% por vía intramuscular la cantidad de 0,2 ml a cada individuo de peso promedio 120 g. Luego de 2 h de tratamiento los peces fueron sacrificados por punción cerebral, se extrajeron los riñones anteriores y se obtuvo una suspensión celular que se dejó en reposo por 25 min a temperatura de 37 °C. Posterior a este tiempo se centrifugó a 1000 rpm por 10 min, se eliminó el sobrenadante y al precipitado se agregó fijador (alcohol absoluto: ácido acético en proporción de 3:1, respectivamente), luego de 10 min a temperatura de 4 °C se realizó la suspensión celular y fue centrifugado a 1000 rpm por 10 min. Se eliminó el sobrenadante y se agregó nuevo fijador y se dejó caer una o dos gotas sobre una lámina limpia y seca. Posteriormente fue coloreada con Giemsa al 2% en buffer fosfato pH 6,8 para su revisión al microscopio óptico OLYMPUS BX53, ocular 10X y objetivo 100X (Rivlin et al., 1985).

Obtención de espermatocitos en paquitenos. Se obtuvieron muestras de testículos de los individuos machos XY O. niloticus del cruce de machos YY con hembras genéticas XX. Los individuos en edad adulta fueron sacrificados por punción cerebral y las gónadas masculinas extraídas fueron colocadas en una solución de 0,075M de cloruro de potasio contenida en una luna de reloj. Inmediatamente, se procedió a seccionar transversalmente las gónadas y la suspensión celular obtenida se colocó en un tubo de centrífuga de 15 ml de capacidad y fue centrifugada a 800 rpm por 1 min. El sobrenadante de la muestra centrifugada fue vertido en otro tubo de la misma capacidad y se mantuvo en reposo por 27 min a 37 °C. Luego, se centrifugó a 800 rpm por 5 min y el precipitado fue re suspendido en una solución de Carnoy (alcohol absoluto y ácido acético en una proporción v/v de 3:1). Se dejó en reposo por 10 min y luego de realizar la resuspensión celular se volvió a centrifugar a 1000 rpm por 6 min; se eliminó el sobrenadante, se repitió este último procedimiento tres veces y se dejó caer una gota sobre cada lámina limpia y seca. Posteriormente, los extendidos cromosómicos fueron coloreados con Giemsa al 2% en buffer fosfato con un pH de 6,8.

Las observaciones se realizaron en microscopio óptico a magnificación de1000X, se tomaron fotografías de las mejores vistas, enfocadas en el par cromosómico más pequeño del complemento diploide. Se revisaron 5 fotografías de cada individuo para estimar el número de espermatocitos con y sin sinapsis parcial o total. Se consideró 5 fotografías como representativo en cada individuo debido a que no hubo variaciones dentro y entre individuos.

3. Resultados y discusión

Se evaluaron 4 pares de nuevos cebadores por PCR en tiempo real con SYBR Green, un par asociados al cromosoma sexual X, un par asociados al cromosoma sexual Y, un par asociados a ambos cromosomas X y Y, y un par que corresponde a la secuencia promotora del gen β-actina. En la Tabla 1 se muestran los tamaños de fragmentos esperados y observados en el gel de agarosa 1,5%. Los productos amplificados por PCR punto final con los marcadores SCAR-5X y SCAR-Y fueron concordantes a los resultados de Sun et al. (2014). Sin embargo, con el marcador SCAR-5Y en algunos individuos machos mostró inconsistencia, probablemente por las diferencias en el Tm entre el cebador F con respecto al reverse.

Los productos PCR secuenciados en los individuos utilizados en la presente investígación con los marcadores SCAR-X y SCAR-Y mostraron homología con las secuencias registradas en la base de datos del GenBank con las accesiones KC710223 y KC710224 para O. niloticus. Teniendo en cuenta la homología presentada entre las muestras secuenciadas con las accesiones KC710223 y KC710224 de O. niloticus, se diseñaron cebadores para PCR en tiempo real: cebadores para qPCRX ubicadas en la región interna del SCAR 5FX-5R, que no tiene homología con la secuencia de la accesión KC10224 del cromosoma Y; los cebadores para qPCR-Y ubicadas en la secuencia interna de la accesión KC710224 del cromosoma Y, en este caso, uno de los cebadores fue diseñado en la interrupción de la homología del Y con el X. Los cebadores del marcador qPCR-I se ubican en las secuencias homólogas del cromosoma X y el cromosoma Y (Figura 1).

En la Figura 2 se observan las bandas de los productos amplificados por la PCR punto final en muestras de ADN de hembras XX, machos XY y machos YY. Con el marcador qPCR-X se registraron fragmentos PCR de tamaño~125bp en las hembras XX y en los machos XY, banda que fue ausente en los machos YY (Figura 3.A) y con los cebadores del marcador qPCR-Y amplificaron solo en los machos YY y XY a Tm 60 °C, tamaño de fragmentos PCR en ~126 (Figura 2.B).

Con los cebadores qPCR-I se obtuvieron productos PCR de ~60bp en todos los individuos XX, XY y YY confirmando lo esperado (Figura 2.C); y, en la Figura 3.F se observan las bandas del control interno β-actina tanto en hembras como en machos (~103).

Como se demuestra en los resultados, los marcadores denominados qPCR-X, qPCRY, qPCR-I y qPCR-β actina existe correspondencia con los tamaños de fragmentos amplificados esperados. Luego de la estandarización de los marcadores qPCRX, qPCR-Y, qPCR-I y qPCR de βactina con diferentes concentraciones de ADN por la PCR en tiempo real (Termociclador 7500, Applied Biosystems), se obtuvieron resultados concordantes a los productos obtenidos por PCR punto final. El marcador qPCR-X amplificó en las hembras XX y en los machos XY y la amplificación fue negativa en las muestras de los individuos YY (Figura 3. A y B); el marcador qPCR-Y amplificó solo en los machos XY y YY (Figura 3. C y D). menor Tm es posible la amplificación de la secuencia del cromosoma X por la posibilidad de mantener la hibridación parcial en el extremo 3´ de uno de los cebadores. En la Figura 3. E y F, se muestran los productos PCR tanto en las hembras XX como en los machos YY y de manera similar, la amplificación fue positiva en hembras y machos con los cebadores del control interno β-actina (Ct de 20,43 ± 0,10).

Los protocolos realizados con la PCR en tiempo real SYBR Green demuestran especificidad, rapidez y sensibilidad asociados a los cromosomas sexuales X y Y, y por ser secuencias internas de las accesiones KC710223y KC710224, los loci de los marcadores propuestos estarían localizados en el par cromosómico más pequeño, como lo fue propuesto por Sun et al. (2014) en base a los estudios de segregación de marcadores SCAR con el sexo fenotípico y pruebas de hibridación in situ por fluorescencia (FISH).Propuesta de la ubicación de los loci determinantes del sexo dentro de LG23 en los cromosomas de menor tamaño fue anteriormente reportado por Lee et al. (2003), Ezaz et al. (2004), Cnaani et al. (2008).

En este sentido, se enfocó el estudio citológico de la determinación de apareamiento total de los cromosomas en el bivalente más pequeño y en todos los espermatocitos XY evaluados se observó el mismo resultado. En la Figura 4.A, se muestran los 44 cromosomas en metafase de muestras de tejido renal de un individuo macho XY y en la Figura 4.B, se observa un espermatocito en paquiteno de un macho XY O. niloticus, en la que se señala el bivalente más pequeño en completa sinapsis.

En todos los espermatocitos analizados se observó sinapsis total del bivalente más pequeño en los individuos machos XY y supermachos YY (Tabla 2). Aun cuando la resolución con la coloración Giemsa es gruesa, se puede asumir que no se presentaron diferencias en la sinapsis del bivalente más pequeño con el resto de bivalentes.

Al revisar las figuras reportadas por Foresti y Oliveira (1993), de extendidos celulares de espermatocitos de machos XY O. niloticus en la fase de paquiteno en alta resolución (microscopio electrónico) en la que muestran el complejo sinaptonémico de los bivalentes se observa sinapsis total en el bivalente más pequeño y asinapsis parcial del bivalente de mayor tamaño (par 1).

Carrasco et al. (1999) reportaron la asinapsis de una región cromosómica del primer par de bivalentes de mayor tamaño en un porcentaje de 25,7% y bivalentes con apareamiento total en 74,3% y propusieron que los cromosomas sexuales serían los cromosomas de mayor tamaño. Ocalewiez et al. (2009) realizaron tinciones de bivalentes con DAPI y sondas de hibridación del gen dmrt4 (FISH) y reportaron la señal en el bivalente 1 en O. niloticus y apoyaron la propuesta de Carrasco et al. (1999). Sin embargo, los estudios sobre la asinapsis parcial en paquitenos de espermatocitos de individuos XY no son del todo concluyentes, por el alto porcentaje de espermatocitos con sinapsis total en el bivalente de mayor tamaño.

Por un lado, los cariotipos de cromosomas metafásicos en muestras de hembras y machos, tanto por coloración simple como con tinciones de bandeo de secuencias repetidas por hibridación, no ponen de manifiesto diferencias citológicas distinguibles entre sí (Supiwong et al., 2013) y en espermatocitos en paquiteno no se detectan diferencias citológicas en el bivalente más pequeño entre machos XY y machos YY. Por otro lado, se ha demostrado que existen diferencias en las secuencias de ADN en las regiones asociadas a los cromosomas sexuales X y Y a través de los marcadores utilizados en la presente investigación y la secuenciación realizada con los productos PCR obtenidos con los marcadores SCAR-5X y SCAR-5Y propuestos por Sun et al. (2014).

En este sentido, se propone un modelo de configuración de la sinapsis de los cromosomas sexuales en paquiteno en los individuos XY, utilizando para ello, las secuencias de los loci KC710223 y KC710224 en los cromosomas X y Y, respectivamente (Figura 5). Se muestran regiones apareadas entre los loci y las secuencias no homólogas formarían lazos de reducido tamaño que no son detectables citológicamente por coloraciones convencionales. Por la alta similitud de secuencias entre los cromosomas sexuales X y Y, y las reducidas secuencias de alelos específicos que los diferencian en las regiones determinantes del sexo es probable que ocurra similar configuración durante las fases de cigoteno y paquiteno de espermatocitos XY de O. niloticus.

La determinación del sexo fenotípico se daría por la expresión de genes existentes en el par cromosómico de menor tamaño y probablemente en los cromosomas de mayor tamaño. Sin embargo, habría solo un par de cromosomas que tendría el locus o loci que da la primera señal para la determinación del sexo. Por los antecedentes y los estudios realizados en machos YY y XY y hembras XX, se propone que tales genes estarían en el par más pequeño. Entre los genes candidatos en la determinación del sexo se reportó al gen amh (Eshel et al., 2014; Li et al., 2014), que fue anteriormente ubicado en el LG23 (Eshel et al., 2011; Eshel et al., 2012).

Los marcadores moleculares asociados a los cromosomas X y Y, constituyen herramientas para la identificación del sexo genético de reproductores para obtener las progenies deseadas de acuerdo con el tipo de cruces que se programe y de mayor importancia en los peces, por la frecuencia de casos de reversión sexual natural o inducida que se producen. En tilapia, se han registrado hembras XX y neohembras ∆XY y ∆YY fenotípicamente indistinguibles y funcionalmente fértiles; de manera similar, no es posible diferenciar a simple vista los machos XY, YY y neomachos ∆XX. Entre los factores físicos que afecta a los individuos, particularmente a las hembras, durante el período crítico de diferenciación gonadal, es la temperatura. Baroiller et al. (1995) reportaron la reversión de hembras XX a machos fértiles al ser expuestas a temperaturas de 36 °C y registraron una proporción de 81% de machos superior a la esperada (50%).

Investigaciones sobre los efectos de la temperatura en hembras XX han contribuido a identificar algunos genes que por la magnitud de su expresión consolidarían ya sea el sexo masculino o femenino. Poonlaphdecha et al. (2013) reportaron la expresión de los genes foxI2 y cyp19a1a implicados en el desarrollo ovárico, y los genes demrt1 y amh asociados al desarrollo testicular y observaron un incremento significativo de los genes dmrt1 y amh y represión del gen fox12 en las hembras XX después de 17-19 días luego de la fecundación. De manera similar, la masculinización de hembras XX por efecto hormonal fue evidente y se reportó la activación de los genes dmrt1 y sox9a (Kobayashi et al., 2008).

Otros factores de regulación involucrados en la determinación sexual serían la presencia de microRNA (miRNA), pequeños ARN no codificantes que se expresan de manera diferencial entre sexos (Eshel et al., 2014) o los procesos epigenéticos, como los procesos de metilación de promotores, que podrían activar o reprimir la expresión de los genes mayores determinantes de la masculinidad o femineidad. Sun et al. (2016) demostraron el incremento de niveles de metilación en varios cromosomas de ambos sexos de O. niloticus después de haber estado expuestos a altas temperaturas.

Las investigaciones sobre la reversión sexual de hembras XX a neomachos ∆XX, o de machos XY o YY a neohembras por factores ambientales o efectos epigenéticos y la alta homología entre los loci determinantes del sexo genético explicarían que las diferencias genéticas entre hembras y machos estarían reguladas por mecanismos de expresión diferencial más que por diferencias grandes entre los loci determinantes del sexo y en consecuencia la ausencia de dimorfismo citológico entre los cromosomas X y Y.

4. Conclusiones

La investigación aporta 4 pares nuevos de cebadores para PCR en tiempo real con SYBR Green; qPCR-X, que discrimina la presencia o ausencia del cromosoma X; qPCR-Y, que distingue la presencia o ausencia del cromosoma Y; cebadores qPCR-I y qPCR-β actina que amplifican en ambos sexos hembras XX y machos XY y YY utilizadas como control interno de amplificación. Los marcadores qPCR tienen mayor ventaja en sensibilidad, con posibilidades de cuantificación que los marcadores PCR punto final. Por la mayor magnitud de la homología que las diferencias entre las secuencias de los cromosomas X y Y, la asinapsis en el bivalente más pequeño no fue detectada por la coloración Giemsa en los espermatocitos en paquiteno de los machos XY. Con técnicas más resolutivas, en futuras investigaciones, se podrían detectar las secuencias de ADN no homólogas a nivel citológico entre los loci determinantes del sexo genético en espermatocitos en paquiteno de machos XY O. niloticus.

Agradecimientos

Agradecemos al PhD Julio León por su asesoría en los diseños de cebadores y pruebas moleculares. Así también se agradece a los directivos de la Universidad Nacional de Trujillo (UNT) por las facilidades brindadas para el desarrollo de esta investigación. Proyecto financiado con recursos de CANON minero de la UNT Proyecto Mejoramiento genético de tilapia.

 

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Corresponding author
E-mail:
zapl99@yahoo.com (Z. Prieto)

 

Received April 12, 2017.
Accepted
October 07, 2017.

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