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Scientia Agropecuaria

Print version ISSN 2077-9917

Scientia Agropecuaria vol.10 no.2 Trujillo Apr./Jun. 2019

http://dx.doi.org/10.17268/sci.agropecu.2019.02.14 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Obtención de un ADN complementario que codifica una fructano 1-exohidrolasa en yacón, Smallanthus sonchifolius (Poepp. &Endl.) H. Robinson

Obtaining a complementary DNA encoding a fructan 1-exohydrolase in yacón, Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson

 

Patricia Moreno Díaz1,*; Mariella H. Uchima Flores1; Rosa Cabrera Pintado2; Roger Torres Aliaga2

1 Departamento Académico de Biología-Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. La Molina s/n La Molina Lima-Perú. Apartado 12-056 La Molina.

2 Dirección de Recursos Genéticos y Biotecnología – Instituto Nacional de Innovación Agraria. Av. La Molina 1981. La Molina Lima-Perú.


Resumen

El yacón es una planta asterácea originaria de los Andes que en los últimos años ha recibido especial atención por sus propiedades nutricionales y farmacológicas. Sus raíces almacenan fructanos de tipo inulina con bajo grado de polimerización, también llamados fructooligosacáridos (FOS). La pérdida de los FOS en las estructuras reservantes con la consecuente disminución de sus propiedades funcionales están relacionadas directamente con la actividad de la enzima fructanoexohidrolasa (FEH). Las plantas de yac ón fueron obtenidas de la estación experimental "Baños del Inca" perteneciente al Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA). Examinando cuatro métodos de extracción de RNA total a partir de las raíces reservantes, se obtuvo un mejor rendimiento y calidad con el método CTAB modificado. El juego de cebadores diseñados y la técnica de RT-PCR generaron fragmentos traslapados del gen feh, así como el extremo 3’ del ARNm. El ensamblaje de los fragmentos permitió determinar cerca del 80 por ciento de la secuencia del gen y la región no codificante del extremo 3’. La construcción del árbol filogenético mostró un alto grado de identidad de la secuencia con las 1-FEHs de: C. intybus (88,5 %), H. tuberosus (88,2 %), V. herbácea (86,5 %) y A. lappa (85 %).

Palabras clave: Yacón; CTAB; RT-PCR; 1-FEH.


Abstract

Yacon (Smallanthus sonchifolius) is an asteraceous plant native to the Andes that in recent years has received special attention for its nutritional and pharmacological properties. Its roots store fructans of inulin type with low degree of polymerization, also called fructooligosaccharides (FOS). The loss of FOS in the yacon reserve structures and the consequent decrease of its functional properties are directly related to the hydrolytic activity of the enzyme fructanexohydrolase (FEH). Yacon plants were obtained from the "Baños del Inca" experimental station, belonging to the National Institute of Agrarian Innovation (INIA). By examining four methods of extracting total RNA from the storage roots, better performance and quality were obtained with the modified CTAB method the designed primer sets and the RT-PCR technique generated overlapping fragments of the feh gene, as well as the 3'-end of the mRNA. The assembly of the fragments allowed to determine about 80 percent of the gene sequence and a 3’untranslated region. Construction of the phylogenetic showed a high degree of identity of the sequence with the 1-FEHs of: C. intybus (88.5 %), H. tuberosus (88.2 %), V. herbacea 86.5 %) and A. lappa (85 %).

Keywords: Yacon, CTAB, RT-PCR, 1-FEH.


1. Introducción

El yacón Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.) H. Robinson, es una planta de origen andino que contiene altos niveles de fructanos con bajo grado de polimerización (Ohyamaet al., 1990; Gotoet al., 1995; Grau y Rea, 1997; Seminario et al., 2003) también llamados fructooligosacáridos (FOS). Estos representan el 52 a 66% del total de carbohidratos en base seca mientras que los azúcares simples como glucosa, fructosa y sacarosa se encuentran en baja proporción (Ohyama et al., 1990; Hermann et al., 1998; Lachman et al., 2004). Los fructooligosacáridos del yacón han sido identificados como fructanos del tipo inulina basado en el trisacárido 1-cestosa con uniones β-2,1 entre los residuos de fructosa, una sacarosa terminal (Ohyama et al., 1990; Itaya et al., 2002) y un GP promedio de 3.6-4.3 (Hermann et al., 1998). La proporción relativa de FOS y monosacáridos fluctúan significativamente durante el ciclo de crecimiento y después de la cosecha, lo cual se evidencia en los diferentes datos publicados (Ohyama et al., 1990; Fukai et al., 1993; Fukai et al., 1997; Hermann, et al., 1998; Itaya et al., 2002). Los FOS han recibido últimamente mucha atención por su significancia en nutrición humana ya que son resistentes a la digestión, pero susceptibles a la fermentación de la microflora intestinal, lo que conduce al desarrollo de funciones colónicas favorables y la estimulación selectiva del crecimiento de bifidobacterias en el colon (Grau y Rea, 1997; Ritsema y Smeekens, 2003a; Pedreschi et al., 2003). Los fructanos y los FOS son sintetizados a partir de la sacarosa por la acción de fructosiltransferasas. Para la síntesis de fructanos de tipo inulina dos transferasas son responsables: una sacarosa: sacarosa fructosiltransferasa (1SST) que cataliza irreversiblemente la formación de 1cestosa a partir de dos moléculas de sacarosa liberando una de glucosa, y una de fructano: fructano fructosiltransferasa (1-FFT), responsable por el elongamiento de la cadena de fructano, catalizando la transferencia reversible de residuos terminales de fructosa de una 1-cestosa proveniente de fructanos con grado de polimerización  a 3, a una receptora (Hendry,1993; Vijn y Smeekens, 1999; Ritsema y Smeekens, 2003; Ritsema y Smeekens, 2003a) . La movilización de los FOS en las plantas que acumulan fructanos tipo inulina ocurre por la actividad de una fructano exohidrolasa (1FEH, EC 3.2.1.153) que preferentemente hidroliza el enlace β 2,1 del residuo fructosil terminal del fructano(Van den Ende et al., 2000; Verhaest et al., 2007; Ueno et al., 2011; Ueno et al., 2015; Van den Ende, 2018)esta enzima no actúa sobre el enlace glicosídico de la sacarosa (Van den Ende et al., 2002; Verhaest et al., 2007).El clonamiento de los genes de las FEHs de diversas especies y los ensayos de expresión han posibilitado hasta el momento el conocimiento de la función de esta enzima en el metabolismo de los fructanos, logrando relacionarlas con estados fisiológicos característicos como la respuesta a la defoliación y a las bajas temperaturas, entre otras. (Van den Ende et al., 2001; Lothieret al., 2007; Portes et al., 2008; Meguro-Maoka y Yoshida, 2016). A partir de estos trabajos se ha podido determinar asimismo la existencia de isoformas de la enzima expresadas bajo ciertas condiciones de crecimiento en la misma planta, asi Van den Ende et al. (2001) aislaron las isoformas 1-FEHIIa y 1-FEH IIb en C.intybus; Ueno et al. (2015) las isoformas A1EH1 y A1EH2 en Arctium lappa L. y Ht1-FEH I y Ht1-FEH II de Helianthus tuberosus en el trabajo de Xu et al. (2015). La pérdida del contenido de fructanos de inulina en los órganos subterráneos de varias asteráceas está relacionada directamente con la expresión y actividad hidrolítica de la enzima fructano 1exohidrolasa (Marx et al., 1997; De Roover et al., 1999; Van den Ende et al., 2001; Itaya et al., 2007; Jiao et al., 2018) y como consecuencia la disminución de las propiedades funcionales de estos alimentos. Esta investigación se centró en obtener el ADN complementario con la información de la secuencia de nucleótidos del gen de la fructano 1-exohidrolasa (1-FEH) de yacón como un primer paso para estudios posteriores de la estructura del gen y función de la enzima.

2. Materiales y métodos

Material vegetal y Extracción de RNA total Las accesiones (PER 018283, PER 018279) de yacón fueron obtenidas de la estación experimental agraria "Baños del Inca", Cajamarca (Perú), perteneciente al Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA). La cosecha de raíces reservantes para la extracción de ARN total se realizó en los meses de enero – marzo de 2016, dónde la temperatura osciló entre 26 °C a 30 °C (La Molina-Lima. Perú), previamente las plantas fueron inducidas a la expresión de la enzima mediante defoliación y su procesamiento para el inicio a la extracción incluyó lavado, corte e inmersión de las raíces reservantes en una solución de ácido ascórbico 0.1 M para evitar su oxidación. Cuatro métodos de extracción: CTAB (Lodhi et al., 1994) modificado, LiCl (Verwoerd et al., 1989) TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Ca) y RNeasy Mini-Kit (Qiagen); fueron utilizados y se optimizó el que mejor resultado proporcionó tanto en rendimiento como en calidad de ARN total. Se cuantificó el producto de la extracción mediante el espectrofotómetro EpochTM y se visualizó la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1% en solución amortiguadora TBE 1X.

RT-PCR, clonado y secuenciamiento del gen putativo de la FEH

Se obtuvo un fragmento de 579 pb utilizando los cebadores P1/P7 (F1 y R1 para este estudio) tomados del trabajo de Asega et al. (2008) y a partir de éste se buscaron homologías en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se consideraron las secuencias: Cichoriumi intybus (AIP90173, CAC37923, AIP90174, AAP85536, CAA72062, CAC37922), Arctium lappa (BAL73222), Vernonia herbacea (CAJ77148), Helianthus tuberosus (AJW31156) para el diseño del cebador específico: 9B2F1 (5’ GGCGGCGATCGGGACAACAAC3’), y los cebadores degenerados; 9B1F1 (5’GGGARAAYTTYTTGCCRCA3’), 9B1R1 (5’GYTTCATMCTCCAAGCACTCAT3’), 9B1R1 (5’gYTTCATMCTCCAAGCACTCAT3’), 9B2F1 (5’ GGCGGCGATCGGGACAACAAC3’), 9B2R2 (5’CCGRAAHGWCTGAAGVCCVGCCCA3’) los cuales fueron utilizados en la obtención de fragmentos del gen putativo de la FEH. A partir de la secuencia obtenida fue diseñado el cebador específico 9B5F1 (5’ GGCGTGTTGGCTATGGCGTCT3’) que en combinación con el cebador dT-Adapt 5'GACTCGAGTCGACATCGA (T17)3’, se obtuvo la región carboxi-terminal y la región no codificante 3’ del gen putativo de la FEH. La obtención de los fragmentos del gen putativo de la FEH se realizó mediante RTPCR, el cADN fue sintetizando utilizando 1 µg de ARN total, 40 pmol de dT-Adapt, 0,2 mM de dNTPs mix, 200 U de transcriptasa reversa SuperScript II (Invitrogen, USA) y 1X de buffer de la transcriptasa en un volumen final de 2 0 µl. Pa ra la PCR se utilizó1 µl del ADNc, 10 pmol de cada cebador, 800 µM de dNTPs, 2mM de MgCl2, 0,5 U de Taq ADN polimerasa Kappa y 1X de buffer de la polimerasa en un volumen final de 20µl. Las condiciones de PCR comprendieron un ciclo inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 minutos seguido de 40 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 45 segundos y 72 °C por 1 minuto y una extensión final a 72 °C por 10 min. Para la obtención de la región carboxiterminal y región no codificante 3’ solo varió la temperatura de hibridación (45 °C). Los productos PCR fueron teñidos con bromuro de etidio y visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en solución amortiguadora TBE 1X y teñidos con bromuro de etidio.

Para la purificación de los productos PCR se utilizó el kit DNA Clean&Concentrator D4014 (Zymo Research). Los fragmentos obtenidos fueron clonados en el plásmido pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, USA) de acuerdo a las condiciones del fabricante, el plásmido recombinante fue utilizado para transformar células competentes de E. coli (DH5α). Después del tamizado de colonias, al menos tres clones fueron secuenciados en ambos sentidos (Macrogen, Korea, USA).

Edición de secuencias y construcción del árbol filogenético

La secuencia ensamblada obtenida fue utilizada para buscar homologías en la base de datos (EMBL Nucleotide Sequence Database (European Molecular Biology Laboratory), BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990). El alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, se realizó mediante los algoritmos Clustal y Muscle respectivamente, del programa MEGA 7, considerando los parámetros predeterminados. Para el cálculo de las distancias de nucleótidos, así como de aminoácidos se consideró el método de la p-distancia, d: transiciones + transversiones y tasas uniformes (Tamura et al., 2007). La construcción del árbol filogenético se realizó empleando el programa MEGA 7. La elección del modelo de evolución molecular (HasegawaKishino-Yanomodel) y la determinación del valor del parámetro Gama, se hizo utilizando el programa MODELTEST integrado en el MEGA 7 (Hasegawa et al., 1985). Se empleó el método de máxima probabilidad ML, y WAG como modelo de sustitución (Whelan et al., 2001).

La validación del árbol filogenético se efectuó mediante el Método de remuestreo – Bootstrap (Felsenstein, 1981) con 2000 repeticiones.

3. Resultados y discusión

Extracción de RNA total

Los resultados de los protocolos utilizados en la extracción de ARN total se visualizan en la Tabla 1 y la integridad del ARN observada en gel de agarosa al 1% se muestra en la Figura 1. El mayor rendimiento de ARN total se obtuvo con los protocolos RNeasy Mini Kit-Qiagen y CTAB en comparación a TRIzol y LiCl 0.1M. El uso del Mini Kit-Qiagen facilitó en gran medida la obtención de ARN de buena calidad y en cantidad suficiente, y disminuyó considerablemente el tiempo de extracción, sin embargo, su uso es limitado por el número de membranas de sílice que contiene cada Kit. Por el contrario, la extracción mediante CTAB admite cuantiosas extracciones y los resultados no difieren significativamente de los obtenidos por Mini Kit-Qiagen.

De acuerdo con Demeke et al. (2009), la técnica de extracción CTAB produce mayor cantidad de ácidos nucleicos y en mayor pureza respecto a otros protocolos (Mini Kit DNeasy Plant y la extracción de Wizard), sin embargo según Tiwari et al. (2012), el método necesita de pequeñas modificaciones pues obtuvieron mejores resultados agregando más concentraciones de NaCl, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y mercaptoetanol, ellos también aumentaron el tiempo y la temperatura del baño de agua para una extracción efectiva. El uso del LiCl en este método permite hacer una precipitación diferencial del RNA, su gran utilidad se ha atribuido a que este reactivo no es eficiente para precipitar sustancias como ADN, proteínas y carbohidratos, permitiendo una precipitación eficiente del RNA (Barlow et al., 1963). A pesar de esto, Chan et al. (2004) así como Rubio y Zapata (2011) han reportado que en algunas ocasiones las altas concentraciones de LiCl pueden contribuir con un incremento en las

cantidades de impurezas (polifenoles y carbohidratos), afectando la concentración y calidad del ARN. La acción de los polifenoles contenidos en la muestra no se pudo evitar, aun utilizando los antioxidantes β-mercaptoetanol y ácido ascórbico. Durante las extracciones se visualizó un leve pardeamiento en las muestras postruptura mecánica sin distinción de los protocolos utilizados.

RT-PCR, clonado y secuenciamiento del gen putativo de la FEH

El primer amplicón obtenido, un fragmento de 579pb, se visualiza en la Figura 2, se le designó como 9B y fue utilizado como base para el diseño de los oligonucleótidos cebadores que permitieron la amplificación de los fragmentos siguientes (Figura 3).

La electroforesis mostró los resultados de la amplificación de fragmentos en el rango de tamaños esperados, 800 pb, 500 pb y 450 pb, en la purificación se obtuvo una adecuada concentración de los fragmentos de 800 y 500 pb. El secuenciamiento de estos productos y su ensamblaje permitió obtener un fragmento de 1550 nucleótidos correspondientes a 516 aminoácidos de la proteína. En estudios similares se halló la estructura completa del ADNc del gen FEH (AM231149) de Vernonia herbacea con 2074 pb de tamaño, y una región codificante de 1,749 pb (Asega et al., 2008); el ADNc (aleh1) de 2,063 pb con una región codificante de 1,746 pb (581 aa) en Arctium lappa L. (Ueno et al., 2011); dos ADNc completos de Helianthus tuberosus L. (Ht1FEH I y Ht1-FEH II), codificando proteínas de 560 y 581 aminoácidos, respectivamente (Luo et al., 2018).

El empleo de la PCR anclada permitió obtener un producto amplificado para el extremo 3’ (Figura 4). La región no codificante 3’ del mRNA del gen putativo de la FEH del yacón, Smallanthus sonchifolius, tiene un tamaño de 292 nucleótidos entre el codón de terminación TAA y el inicio de la Poli A, es ligeramente más pequeña que la región no codificante del gen 1-feh-IIa (AJ295033.1) de Cichorium intybus con 305 nucleótidos y más grande que las regiones no codificantes de los genes 1-feh-IIb (AJ295034.1) de Cichorium intybus con 251 nucleótidos y 1-feh (AM231149.1) de Vernonia herbacea con 258.

Secuencia ensamblada y árbol filogenético

La secuencia parcial de nucleótidos de la enzima 1-FEH (Figura 5) se ensambló manualmente, y el programa Transeq permitió su traducción (Figura 6).

De acuerdo a la información del programa ScanProsite,y como se muestra en la figura 6, la proteína presenta cuatro sitios potenciales de N-glucosilación en las posiciones ubicadas por los residuos; NLSD, NWTR, NSTN y NGTQ. La descripción de otras FEHs, muestran resultados similares: cuatro sitios en la 1-FEH de Triticumaestivum (Van den Ende et al., 2003) y en la 1-FEH de Lolium perenne (Lothier et al., 2007) tres sitios tanto en la 1FEH IIa y 1-FEH IIb de Cichorium intybus (Van den Ende et al., 2001), tres sitios en la 1-FEH de Vernonia herbacea (Asega et al., 2008) y tres en la 1-FEH de Arctium lappa (Ueno et al., 2011). En plantas, los N-glucanos ligados influencian fuertemente la conformación de las glucoproteínas, su estabilidad y actividad biológica, pudiendo además afectar el plegamiento posttraduccional de la proteína (Rayon et al., 1998). La secuencia parcial de la 1-FEH de yacón muestra además dos de los tres motivos altamente conservados que conforman el sitio activo de las glucosil hidrolasas de la familia GH32, que según Henrissat y Davies (1997) agrupa a las enzimas que metabolizan fructanos y a las invertasas de tipo vacuolar y de pared. En el análisis de la estructura proteica de la 1FEH IIa de C.intybus, Verhaest et al., (2005) señalan tres aminoácidos que son altamente conservados dentro de las glicosil hidrolasas de la familia 32 y que cumplen un rol fundamental en el mecanismo catalítico de la enzima, éstos son: Asp22, Asp147 y Glu201, que son parte respectiva de los tres motivos NDPNG, FRDP y WECPD del sitio activo. Haciendo analogía con esta estructura y la de otras enzimas de la misma familia, la 1-FEH putativa de yacón presenta los aspartato y glutamato de los dos últimos motivos y el aspartato restante se encontraría en el primer motivo aún no determinado. En la Figura 6 pueden observarse también los sitios de posible N-miristoilación, de función aún no establecida en los residuos; GNipAM, GSdsNS, GLdtSA, GLklSG, GQfyAS, GVtaSQ y GGktCT. Estos sitios se encuentran presentes en otras fructano exohidrolasas, el fragmento del gen muestra al parecer pertenencia a la superfamilia GH32_62_32_68 (glucosil fructosidasas), con presencia de multidominios Glyco_32 (glucosil hidrolasas 32), SacC (Sucrosa 6 fosfato hidrolasa SacC – metabolismo y transporte de carbohidratos) y scrB_fam (Sucrosa 6 fosfato hidrolasa – metabolismo energético y biosíntesis y degradación de polisacáridos).

La secuencia de aminoácidos de la FEH de yacón tiene un alto grado de identidad respecto a las 1-FEHs de especies emparentadas (Figura 7), siendo estos valores: C. intybus (88,5 por ciento), H. tuberosus (88,2 por ciento), V. herbacea (86,5 por ciento) y A. lappa (85,0 por ciento).

El árbol consenso Bootstrap obtenido a partir de 2000 réplicas (Figura 8) indicó un 89 por ciento de credibilidad del nodo que relaciona las secuencias FEH de S. sonchifolius y la 1-FEH de H. tuberosus.La similitud con otras fructano exo-hidrolasas de miembros de la familia Asteraceae, su ubicación en un clado conjuntamente con la FEH de H. tuberosus y relativamente separada de las FEH de Cichorium intybus y Vernonia herbacea, sugieren que el gen 9B de yacón podría ser una forma alélica distinta a las anteriormente descritas para la actividad 1-FEH. Cabe resaltar que Helianthus tuberosus es una asterácea que a similitud del yacón contiene fructooligosacáridos cuya concentración varía de acuerdo a la etapa de crecimiento y al estado fisiológico en el que se encuentre (Itaya et al. 2002; 2007; Luo et al., 2018; Jiao et al., 2018), lo cual sugeriría uno o más patrones de expresión, formas alélicas específicas o un control mediado por las fructosiltransferasas e hidrolasas del metabolismo de los fructanos en cada especie. Se hacen necesarios ensayos complementarios posteriores para completar su caracterización.

4. Conclusiones

La estandarización del protocolo de extracción CTAB permitió la obtención de un ARN total de buena cantidad y calidad a partir del tejido fresco de raíces de yacón (PER018279). Las modificaciones del protocolo se basaron en el uso de mayor concentración de ácido ascórbico y βmercaptoetanol. El ensamblaje y análisis de los amplicones obtenidos correspondió con la estructura parcial de un gen con probable actividad exohidrolasa (1-FEH) en raíces reservantes de yacón. El extremo no codificante del ARNm del gen 1-FEH correspondiente a la región 3’ mostró un tamaño esperado de 292 bp. La secuencia 1-FEH de yacón obtenida mostró un alto grado de identidad con las 1-FEHs de otras asteráceas C. intybus (88,5 por ciento), H. tuberosus (88,2 por ciento), V. herbácea (86,5 por ciento)y A. lappa (85 por ciento).La secuencia de aminoácidos de la 1-FEH en yacón expuso tres probables sitios de N-glucosilación y dos de los tres sitios de las regiones consenso del sitio activo que confirmarían la identidad de 1FEH.

Agradecimientos

Los autores agradecen al proyecto PI-092 PNIA por el financiamiento de esta investigación y al Mg. Marco Gálvez Gargurevich. por sus aportes y recomendaciones para el inicio de este trabajo.

 

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* Corresponding author

E-mail: pamodisa@lamolina.edu.pe (P. Moreno).

 

Received February 27, 2019.

Accepted June 12, 2019.

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