Secuenciación de ARN

El ARN total fue extraído a partir de las hojas usando el reactivo reagent(r) TRI, siguiendo el protocolo de la compañía proveedora. Sin embargo, en el paso final del protocolo se realizó una precipitación adicional con acetato de sodio pH 5,2. Las librerías se prepararon a partir de ARN total utilizando el kit TruSeq Strandedm RNA (Illumina) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La secuenciación se realizó con el sistema NovaSeq 6000 (Illumina) por 200 ciclos (2 x 100 pb).

Análisis diferencial de expresión génica

Los adaptadores fueron seleccionados y retirados junto con los tramos de baja calidad usando el programa Trimmomatic v0.36 (^{Bolger et al., 2014}), con los parámetros siguientes SLINGWINDOWS: 4: 15 y MINLEN: 75. Las librerías limpias se evaluaron con el programa FastQC (^{Wingett y Andrews, 2018}) y se mapeó al genoma de referencia de Chenopodium quinoa Cq_PI614886_V1_pseudomolecule (^{Jarvis et al., 2017}) utilizando el alineador STAR v2.7a (^{Dobin et al., 2013}) con parámetros estándar. Las alineaciones ordenadas por coordenadas (BAM) se utilizaron para producir una tabla de conteo utilizando el Programa featureCounts del paquete Subread v1.6.4 (^{Liao et al., 2013}) con parámetros estándar.

El análisis de expresión génica diferencial se realizó con el paquete estadístico R usando la librería bioconductor edgeR v3.26.5 (^{Robinson et al., 2010}; ^{McCarthy et al., 2012}). Se realizó un filtrado inicial de los genes de recuento bajo (logCPM <= 1 en menos de 3 bibliotecas) antes de la normalización del recuento con la media recortada de los valores M (TMM). La estimación de dispersión, el ajuste del modelo binomial negativo y la prueba de expresión diferencial se realizaron utilizando el método de cuasi likelihood (QLF). Se seleccionaron resultados significativos utilizando un umbral de FDR <= 1e^-2 y LFC > = 1. Se produjeron mapas de calor (Heat maps) de genes expresados diferencialmente con el programa Complex Heamap v2.0.0 (^{Gu et al., 2016}).

Análisis funcional

Los genes seleccionados fueron anotados funcionalmente con la herramienta en línea InterProScan v5.0 (^{InterPro, 2019}).

Selección de plantas e índice de contenido de clorofila

En la Tabla 2 se muestran las variedades de Chenopodium quinoa Willd clasificadas como tolerantes y susceptibles a la sequía. Las variedades evaluadas presentaron una respuesta fisiológica diferente a la sequía, principalmente durante el proceso posterior a la floración; cq01, fue la variedad más susceptible, disminuye su contenido de clorofila al sexto día de estrés por sequía y recupera su nivel de clorofila 14 días después de recibir nutrientes y agua. Ello se debe a la capacidad de la quinua en recuperar rápidamente su nivel fotosintético anterior y su área foliar después de un período de sequía (^{Jacobsen, 2009}). Mientras que, cq05 y cq37 muestran mejor respuesta a la exposición a la sequía, Según ^{Issa et al. (2019}) la tolerancia de la quinua a la sequía sea el resultado de su capacidad para mantener el estado de salud celular. Similar resultado fue reportado por ^{INIA (2013)} para la variedad cq05; sin embargo, ^{Apaza et al. (2013}) reportaron moderada tolerancia a la sequía acq05 y tolerante a la sequía a cq37. Mientras que, ^{Al-Naggar et al. (2017}) y ^{Iqbal et al. (2018)} reportaron los genotipos CICA-17 y, 2-Want e IESP como tolerantes a la sequía respectivamente.

Tecnología de secuenciación de ARN (RNA-seq)

En total se produjeron y secuenciaron 12 librerías (Tabla 3) por variedad (seis en prefloración, tres controles posfloración y tres sequías posfloración). En promedio, se produjeron 21 millones de lecturas emparejadas por librería (42 millones de lecturas) y alrededor del 10% de las lecturas se eliminaron después del recorte de calidad. De los 19 millones de lecturas emparejadas por biblioteca restante, el 83,5% se asignó al genoma de referencia del C. quinoa y el 82,1% de ellas se asignaron a una característica anotada en el genoma de referencia de las variedades en estudio.

De los ~ 44 mil genes que se encuentran en el genoma de C. quinoa (^{Zou et al., 2017}), se mantuvieron aproximadamente 24 mil después del filtrado de genes de bajo conteo.

El número de genes expresados diferencialmente se resume en la Tabla 4. Las comparaciones de los cambios comunes en PRE-CPOS y PRE-DPOS se muestran en la Tabla 5.

En cq01 se encontraron 554 genes expresados diferencialmente (DEG) (351 regulados al alza y 203 de baja regulación) en la comparación PRE - CPOS, mientras que solo se encontró un gen (regulado al alza) en la comparación PRE - DPOS.

Tabla 4 Número de genes expresados diferencialmente 

Tabla 5 Comparación de los genes en los cambios comunes en PRE-CPOS y PRE-DPOS 

B: Baja expresión

A: Alta expresión

En la comparación CPOS - DPOS, se encontraron 82 DEG (33 regulados al alza en DPOS y 49 regulados a la baja). La comparación de los DEG de PRE-CPOS y PRE-DPOS mostró que en ambas situaciones los genes afectados son completamente diferentes y todos los cambios que ocurren naturalmente bajo riego regular después de la floración se neutralizan cuando se exponen a la sequía.

En cq05 se encontró un total de 2 174 DEGs entre CPOS y PRE (1367 regulados al alza y 807 de baja regulación) mientras que 1298 DEGs se encontraron entre DPOS y PRE (1014 regulados al alza y 284 de baja regulación). No se encontraron diferencias entre DPOS y CPOS. Similar a cq01, la comparación entre los DEG en los grupos PRE-CPOS y PRE-DPOS mostró que el 57% de los DEG en PRE-CPOS no se expresan diferencialmente en PRE-DPOS, lo que sugiere que la mayoría de los cambios naturales que se producen en la hoja después de la floración se neutralizan por exposición a la sequía. El 43% restante mantuvo un patrón de expresión similar, a excepción del gen AUR62002318 que se reguló rápidamente bajo condiciones de riego regular y se redujo bajo sequía. Este gen es un análogo de gen resistente a la enfermedad que contiene un dominio de unión a ADN B3, 2 regiones ricas en leucina y un dominio NB-ARC. Este dominio regula la muerte celular programada y es capaz de enlazar nucleótidos de adenosina o guanina (^{Giménez et al., 2006}). Finalmente, el 73% de los DEG bajo tratamiento de sequía también se encontraron en condiciones de riego normales. Los resultados obtenidos indican que 355 genes son parte de la respuesta real a la sequía en cq05, mientras que los 943 genes restantes también son parte del desarrollo natural de la planta. Este resultado está en contraste con cq01, donde ninguno de los cambios que ocurrieron naturalmente se mantuvo en la respuesta a la sequía.

En cq37 se encontró un total de 76 DEG (nueve de baja regulación y 67 regulados al alza) en el análisis PRE-CPOS; mientras que, se encontraron 29 genes regulados al alza en el análisis PRE-DPOS. No se encontraron DEG entre los grupos DPOS y CPOS, similar resultado se obtuvo en cq05. Lo que sugiere que ambos grupos tienen patrones de expresión similar. En cq05, la gran mayoría de los cambios de expresión (68%) bajo riego normal se neutralizaron cuando se expusieron a la sequía. En cq37, 24 de los 29 (83%) genes regulados al alza en la comparación PRE-DPOS también se encontraron regulados al alza bajo riego regular. Estos resultados sugieren que la mayoría de los cambios causados por la floración bajo riego regular no ocurren cuando se exponen a la sequía. Además, solo cinco genes (AUR62037809, AUR62000271, AUR62037807, AUR62042825 y AUR62009791) tuvieron un cambio en su patrón de expresión como consecuencia de la exposición a la sequía. Tres de los cinco genes eran tiolasas con actividad de transferencia de acilo prevista, mientras que los dos restantes eran una proteína de unión a fosfatidiletanolamina y una oxidorreductasa dependiente de NADP.

En todas las variedades analizadas se observó un patrón similar, donde los cambios transcripcionales normales que siguen a la floración bajo riego regular se ven interrumpidos casi por completo por la exposición a la sequía. En cq01 este cambio fue completo y ninguno de los cambios de expresión que ocurrieron naturalmente se encontró bajo privación de agua. Mientras que, en cq05 y cq37, entre el 32% y el 43% de los cambios naturales no se vieron afectados por el estrés hídrico. Además, en las variedades tolerantes, entre el 73% a 83% de los cambios observados en los grupos expuestos a la sequía también se observaron en los grupos de control, lo que sugiere que estos genes no respondieron a la sequía.

Las variedades estudiadas presentan perfil similar de evolución de ICC para el control y tratamiento, se esperaba que sus patrones de expresión también reflejen este comportamiento. Sin embargo, mientras cq01 (susceptible) bajo estrés por sequía tuvo pocos cambios transcripcionales en comparación con el control (estado vegetativo), cq05 como cq37 (tolerante) permitieron que una fracción (~ 37%) de los cambios transcripcionales permaneciera en su lugar y la mayor parte de su respuesta a la sequía (~ 78%) fue idéntica al control. Este patrón de expresión convergente como respuesta al estrés por sequía es una característica común de C. quinoa tolerante a la sequía (^{Claeys e Inze, 2013}). El hecho de que la mayoría de los genes que no responden a la sequía en plantas tolerantes también se expresaron en la planta susceptible, sugiere que estos genes están controlados por un factor de expresión diferente en ambos grupos. Es posible que las regiones promotoras de estos genes hayan mutado y, por lo tanto, no responden a los mismos estímulos que en las plantas susceptibles. También, es posible que el factor de transcripción que controla estos genes se haya desactivado y, por lo tanto, no pueda producir estos cambios.

Finalmente, son 26 genes los que se comportaron de manera similar en las variedades tolerantes a la sequía (cq05 y cq37), 17 de los cuales se encontraron regulados positivamente después de la floración bajo riego regular y estrés por sequía; tres fueron regulados negativamente en las plantas de control, pero no en los expuestos a la sequía y seis en las plantas de control, pero no en los expuestos a la sequía. No se encontraron genes en común entre aquellos que cambiaron el patrón como consecuencia de la exposición a la sequía sola. Solo tres de los 26 genes se encontraron regulados al alza en las plantas de control de cq01. Sin embargo, los 26 genes se encuentran con niveles significativos de expresión en las tres variedades (logCPM promedio = 5,03).