Aislamiento y caracterización molecular de las cepas fúngicas y del nematodo formador de agallas

Se realizaron cuatro muestreos entre los años 2017 y 2019. Las cepas fúngicas fueron aisladas a partir de nematodos infectados y material vegetal en descomposición, recolectados en cuatro localidades del Ecuador (Tabla 1). Las muestras colectadas se colocaron en bolsas plásticas y se transportaron al laboratorio donde se mantuvieron en cámaras húmedas (^{Castañeda-Ruiz et al., 2016}).

Se prepararon cultivos monoconidiales de los aislados y se identificaron con claves de identificación taxonómica (^{Barron, 1977}; ^{Cooke & Godfrey, 1964}; ^{Drechsler, 1937}; ^{Matsushima, 1971}, 1975; ^{Rubner, 1996}; ^{Zhang & Hyde, 2014}). Los aislamientos se sembraron en medio de cultivo agar harina maíz (CMA) el cual es escaso en nutrientes y potencia la producción de conidios (^{Duddington, 1955}; J. ^{Li et al., 2014}).

Las cepas se conservaron en la colección de cultivos puros de microorganismos del Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador (CIBE) de la Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL). El ADN fúngico fue extraído empleando el protocolo para amplificación por PCR (^{Cenis, 1992}). La PCR se realizó con los cebadores ITS1 (5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3′) e ITS4 (5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′) (^{White et al., 1990}), empleando el termociclador Aeris™ (ESCO). La longitud, calidad y cantidad de los productos de PCR se confirmaron mediante electroforesis en gel (1% p/v). La identificación y verificación de especies de los aislamientos recolectados se realizó mediante búsqueda de similitud de secuencias en la base de datos de BLAST del GenBank (^{Altschul et al., 1997}). Se empleó el modelo de GTR+G usando el software Geneious 10.2.6 para alineamientos y construcción del árbol filogenético y MEGA-X para edición del árbol.

Para realizar los ensayos in vitro, se mantuvieron a las cepas preservadas en tubos de 2 mL con PDB + Glicerol (^{Ritchie, 2001}), y la reactivación en agar harina de maíz - CMA 1:1, 2% agar, pH 6.3 - 6.4, se colocó en placas de Petri de 9 cm. de diámetro, incubado a temperatura de 27 ±1 ºC, durante siete días.

En todas las pruebas se utilizaron nematodos juveniles de Meloidogyne de la segunda etapa provenientes de un cultivo de tomate (Solanum lycopersicum L.). Se inocularon plántulas de tomate con una sola masa de huevos del nematodo para obtener una sola población con la cual se procedió a desarrollar los experimentos. Esta población de nematodos (codificada como 4N) se mantiene actualmente en plantas de tomate en el invernadero del CIBE-ESPOL. Después de entre 10 y 12 semanas haber inoculado las plantas, sus raíces infectadas fueron colectadas y transportadas para la extracción manual de la masa de huevos, lavando los tejidos cinco veces con agua destilada estéril conteniendo sulfato de estreptomicina (50 ppm). La masa de huevos se colocó en placas de Petri con agar agua más antibióticos y se mantuvieron a 28 ±1°C para que eclosionen. Después de 48 fueron recolectados juveniles de nematodos en segunda etapa (^{Barker et al., 1986}).

Para la extracción del ADN del nematodo se colocó un solo nematodo juvenil J2 en un tubo Eppendorf de 0,2 mL que contenía 50 μL de una solución Buffer (50 mM KC1; 10 mM tris pH 8,2; 2,5 mM MgCl₂; 60 μl/mL de proteinasa K; 0,45% NP40; 0,45% Tween 20; 0,01% gelatina) (^{Castagnone-Sereno et al., 1995}). El ADNr 18S se amplificó utilizando dos conjuntos de cebadores: 1A (5´-GGCGATCGAAAAGATTAAGCC-3´) y 3B (5´-GGCGATCGATTGGCAAATGCTTTCGC-3´) (^{Tigano et al., 2005}). El programa utilizado para la amplificación del ADNr 18S se diseñó en un termociclador Aeris™ (ESCO) con los siguientes ciclos: 1 ciclo a 94 °C durante 7 min., seguido de 35 ciclos a 94 °C por 1 min, 50 °C por 1 min, y 72 °C por 1 min. Al final se dejó a 72 °C por 10 min.

Crecimiento radial y esporulación de los aislamientos

Los medios de cultivo en placas con agar se prepararon con extractos de zanahoria y harina de maíz (20 g agar, 40 g zanahoria, 30 g harina de maíz, 1000 mL H₂O); jugo V8 (20 g agar, 200 mL jugo V8, 800 mL H₂O); harina de maíz (20 g agar, 30 g harina de maíz, 1000 mL H₂O) y de avena (20 g agar, 40 g avena, 1000 mL H₂O). Se usó un control compuesto únicamente de agar agua (20 g agar, 1000 mL H₂O). Todos los medios de cultivo se ajustaron a un pH 6,3 - 6,4.

Se emplearon cinco réplicas de placas de Petri (9 cm Ø) conteniendo 10 mL de medio de cultivo. Se sembraron con un disco de aproximadamente 6 mm de diámetro que se tomaron del borde de una colonia en crecimiento activo y se incubaron a 27±1 °C. Una vez que los hongos crecieron, el plato de Petri se marcó en el borde del avance del crecimiento de la colonia cada 24 horas durante 8 días después de la inoculación. Se registró la cantidad de conidios siguiendo el procedimiento de colocar 5 mL de agua estéril en cada placa de Petri. Posteriormente, se desprendió el micelio, el cual fue recolectado en tubos con el fin de contar el número de conidios por mililitro de agua utilizando la cámara de Neubauer.

Producción de conidios en dos tipos de substratos

Para evaluar la producción de conidios de los aislamientos, se utilizaron dos tipos de substratos: cascarilla de arroz y maíz triturado. Los substratos se colocaron en frascos de vidrio de 200 mL humedecidos con agua destilada, los cuales fueron taponados con algodón y esterilizados dos veces a 121 °C durante 30 minutos, con un reposo de 48 horas. Con un asa bacteriológica estéril se colocó en el centro de cada matraz un disco de 8 mm de diámetro de cada cultivo. Finalmente, los frascos de vidrio se inocularon a 28 °C y se realizaron cuatro conteos a los 7, 10, 13 y 16 días de inoculación, empleando la cámara de Neubauer para calcular el número de conidios/mL H₂O. Los tratamientos fueron: T1 - 10 g de cascarilla de arroz + 20 mL de agua y T2 - 10 g maíz triturado + 20 mL de agua.

Porcentaje de atracción y captura de Meloidogyne sp., por cepas fúngicas

Las cepas empleadas en el experimento se cultivaron en placas de Petri (diámetro de 9 cm) utilizando un medio de agar-harina de maíz para preservar su capacidad depredadora, según la metodología propuesta por ^{Duddington (1955}). En cuanto a los ensayos de atracción, se utilizó una proporción de 1:10 de agar-harina de maíz. La base de la caja se dividió en cuatro secciones iguales, y en cada una de ellas se dispuso un disco de 6 mm de diámetro, situado a 1 cm del borde de la placa, siguiendo el protocolo descrito por ^{Hussain et al. (2018}).

En los cuadrantes I y III, se dispusieron discos con el aislamiento, mientras que en los cuadrantes II y IV se colocaron discos de agar con harina de maíz diluida en agua en una proporción de 1:10, sin presencia del hongo (control). La incubación se llevó a cabo durante 24 horas a 28 °C para permitir el crecimiento del hongo. Posteriormente, se aplicó una gota de agua, previamente ajustada con 50 juveniles de nematodos, la cual se dejó secar durante 1 hora. Finalmente, se procedió a incubar por 24 horas antes de realizar la observación (ver Figura 1).

Figura 1 Ensayo en placa de Petri para la colocación de discos de control, discos con hongo y la población de nematodos. 

El índice de atracción se calculó mediante la fórmula propuesta por ^{Hsueh et al. (2017}):

donde # (I, II, III y IV) corresponde al número de nematodos que se encuentran en cada uno de los cuadrantes a las 72 horas. Así mismo, el número de nematodos capturados fue evaluado para cada aislamiento. Los experimentos se realizaron con 5 repeticiones.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un Diseño Completamente al Azar (DCA). Los datos correspondientes a la evaluación de la esporulación de los hongos en medios y substratos se estandarizaron mediante transformación logarítmica Log (x+1) antes de realizar el análisis estadístico para cumplir con los criterios del análisis de varianza (ANOVA). Después de verificar los supuestos estadísticos y que en el análisis de ANOVA se mostraran diferencias significativas se empleó la prueba de comparación de Tukey (p < 0,05). Para el análisis de datos se procedió a emplear el paquete estadístico InfoStat versión 2020 para Windows.

Identificación molecular de cepas fúngicas

Una vez obtenida las secuencias de las cepas se construyó el árbol filogénico (Figura 2). Las similitudes con BLAST mostraron que las secuencias de ITS de todas las cepas son semejantes con referencia al GenBank (Tabla 2). De los 11 aislamientos fúngicos, nueve corresponden al género Arthrobotrys, uno a Dactylaria y otro a Dactylellina. Estos resultados son semejantes a una investigación previa llevado a cabo por ^{Rubner (1994)}, quien evidenció que entre la diversidad fúngica de especies halladas en diferentes regiones climáticas en Ecuador (Costa, Sierra y Oriente), los hongos más comunes pertenecían al género Arthrobotrys. Según el autor, de las nueve especies de hongos asexuales controladores de nematodos identificados, cinco pertenecían al género Arthrobotrys y cuatro a Monacrosporium. Sin embargo, en Ecuador, la biodiversidad fúngica es poco conocida debido a su extrema riqueza y complejidad (^{Delgado et al., 2021}). Es importante comprender la diversidad fúngica para incluirlos en los planes de manejo integrado de plagas agrícolas (^{Elshafie et al., 2006}), así como para la biorremediación, la industria química y alimentaria (^{Delgado et al., 2021}).

Figura 2 Árbol filogenético de las cepas de los hongos asexuales y su similitud más cercana con los números de accesión del GenBank, con el modelo GTR+G y bootstrap de 1000 réplicas. 

Figura 3 Árbol filogenético del nematodo (4N) y su similitud más cercana con los números de accesión del GenBank. 

Figura 4 Comparación de medias ± desviación estándar del crecimiento radial de las cepas fúngicas en diferentes tipos de medios de cultivos (agar agua, agar extracto de harina de maíz, agar extracto de zanahoria y harina de maíz, agar extracto de avena y agar jugo v8). Letras diferentes encima de las columnas indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Tukey (p < 0.05). 

Como resultado de la amplificación mediante PCR del gen 18S del ADN ribosomal utilizando los ceba dores de nematodos 1A y 3B, se obtuvo amplicones específicos para el nematodo Meloidogyne sp. (Figura 3). Según resultados de investigaciones previas mencionaron que los nematodos formadores de agallas reportadas en Ecuador hasta la fecha fueron cinco especies pertenecientes a los nematodos género Meloidogyne las mismas que corresponden a M. incognita, M. arenaria, M. graminicola, M. hapla y M. javanica, siendo M. incognita la más frecuente en los cultivos agrícolas (^{Calderón et al., 2022}; ^{Chávez-Arteaga et al., 2022}).

Crecimiento radial y esporulación de cepas fúngicas en medios de cultivos

Los resultados de la evaluación del crecimiento de las cepas fúngicas en los medios de cultivo evaluados demostraron diferencias entre los tratamientos. Entre los medios de cultivos, el agar extracto de avena y el agar extracto de harina de maíz fueron los que presentaron los mayores promedios de crecimiento radial con 26,4 mm y 25,9 mm, respectivamente, frente al agar agua y jugo v8 con 23,8 mm y 22,2 mm, respectivamente. Mientras que las cepas que presentaron resultados mayores a 26 mm de crecimiento radial durante los siete días fueron C19-45 (28 mm), C19-54-3 (27,1 mm), C-2197 (26,6 mm), C19-10 (26,5 mm) y C19-54-1 (26,2 mm) (Figura 4).

Las cepas de los hongos asexuales en el presente estudio desarrollaron velocidades diversas de crecimiento. Se ha reportado que el medio de cultivo agar harina de maíz y agar avena proporcionan un buen crecimiento micelial en las cepas de hongos asexuales (^{Martins et al., 2009}; ^{Wang et al., 2017}), mientras que el medio agar agua permite que hongos se desarrollen lentamente por ser un medio escaso en nutrientes (^{Orozco et al., 2015}).

En cuanto a los resultados de la evaluación de la esporulación de las cepas de hongos asexuales, presentaron diferencias siendo el medio de agar extracto de avena con un promedio mayor de esporulación de 2,59 x 10⁶ conidios/mL, seguido del agar jugo v8 y agar extracto de zanahoria y harina de maíz con 2,0 x 10⁶ y 1,9 x 10⁶ conidios/mL, respectivamente. El medio de agar agua fue el que demostró menor cantidad de conidios (2,45 x 10⁵ conidios/mL) (Figura 5).

El agar extracto de avena y el agar extracto de harina de maíz fueron los que presentaron los mayores promedios de crecimiento radial y la mayor esporulación correspondió a agar extracto de avena frente al agar agua como control. El resultado de la esporulación de una cepa de hongo asexual que atrapa nematodos ha sido reportado previamente, donde demostraron que los medios naturales y seminaturales son eficaces para la esporulación de los hongos, pudiendo alcanzar cantidades de 1 x 10⁶ conidios/mL en condiciones controladas (^{Quevedo et al., 2021}). La media de la esporulación en el presente estudio varió entre 2,45 x 10⁵ en el medio de agar agua hasta 2,59 x 10⁶ en el medio agar avena. Estos valores se encuentran dentro del rango correspondiente a una investigación previa donde los hongos producían en diferentes medios de cultivos 1,4 x 10⁴ y 1,01 x 10⁶ conidios/placa de Petri (^{Martins et al., 2009}). En el agar agua los hongos asexuales producen muy poca cantidad de conidios por ser un medio extremadamente pobre en nutrientes (^{Orozco et al., 2015}).

Producción de conidios en dos tipos de substratos

Los resultados de la esporulación de las cepas en los substratos de maíz molido y en cascarilla de arroz en los días 7, 10, 13 y 16 mostraron diferencias entre ambos substratos (Tabla 3). El substrato de maíz molido favoreció la esporulación de las cepas fúngicas con un promedio de 3,01 x 10⁷ conidios/mL, mientras que la cascarilla de arroz resulto con un promedio de 2,86 x 10⁶ conidios/mL. De entre los días evaluados, en el caso del substrato de maíz molido la mayor esporulación se presentó en el día 16 con 3,64 x 10⁷ conidios/mL, con relación al día 7 donde la esporulación fue menor con 2,40 x 10⁷ conidios/mL.

En este estudio se probaron como substratos el maíz molido y la cascarilla de arroz, para observar el crecimiento y esporulación (Figura 6). Según un estudio reporta que las condiciones nutricionales son importantes tanto para la formación de hifas modificadas y especializadas, así como para el cambio de estilo de vida de saprobio a predador, por lo que esta característica les permite colonizar diferentes tipos de fuentes de carbono (^{Orozco et al., 2015}), así como numerosos entornos con materia orgánica en descomposición (^{Swe et al., 2009}).

En otra investigación del maíz junto con otros granos como guisantes y ce bada demostraron buena respuesta de crecimiento y esporulación (^{Kumar et al., 2015}). Además, nos permiten conocer la importancia de los métodos de producción masiva de cepas fúngicas benéficas empleadas en la agricultura (^{Flores et al., 2021}). A pesar de que en el presente estudio la cascarilla de arroz no permitió buena esporulación de los hon gos asexuales, otra investigación muestra que este substrato ha sido empleado con éxito después de 60 días de colonización para la especie del hongo endoparásito Purpureocillium lilacinum llegando a producir 7×10⁷ conidios/g (^{Shirazi et al., 2019}).

Figura 5 Comparación de medias ± desviación estándar de la esporulación de las cepas fúngicas en los medios de cultivos de agar agua, agar extracto de harina de maíz, agar extracto de zanahoria y harina de maíz, agar extracto de avena y agar jugo v8. Letras diferentes encima de las columnas indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Tukey (p < 0.05). 

Figura 6 A) Célula conidiógena y conidios de Arthrobotrys sp. B) Producción de conidios de Arthrobotrys sp. en el substrato de maíz molido a los 10 días de siembra. C) Producción de conidios de Arthrobotrys sp. en cascarilla de arroz a los 10 días de siembra. 

Porcentaje de atracción y captura de Meloidogyne sp. por cepas fúngicas

El porcentaje de atracción y captura presentaron diferencias entre las especies de hongos asexuales evaluadas y los controles. En general los hongos lograron un promedio de 61,13% de actividad predadora frente al 36,7% de los controles (Figura 7). Existen resultados que han demostrado a cepas fúngicas del género Arthrobotrys capaz de causar una tasa de mortalidad significativamente diferente a los controles, por encima del 25% (^{Nicola et al., 2014}). Otros hongos asexuales como Purpureocillium lilacinum y Arthrobotrys oligosporus pueden causar una tasa de mortalidad por encima del 70% (^{Tazi et al., 2021}).

Las cepas que mayor actividad de atracción tuvieron frente a Meloidogyne sp., fueron las cepas de Arthrobotrys sp. C19-1-1 con el 73,6% y Dactylellina sp. C19-48 con el 77,6%. Se ha reportado que A. oligosporus es capaz de depredar y suprimir a juveniles de M. incognita en un 74% frente al 36% tratamiento control (^{Soliman et al., 2021}). Sin embargo, la capacidad de producir sustancias con efectos nocivos para los nematodos depende de cada especie e incluso de cada aislado de hongo asexual (^{de Hollanda et al., 2016}).

Figura 7 A) Comparación de porcentajes ± desviación estándar de la atracción de los nematodos hacia las cepas de hongos asexuales. Letras diferentes encima de las columnas indican diferencias estadísticamente significativas entre las cepas fúngicas y sus controles, según la prueba de Tukey (p < 0.05). B) Estructuras de captura de Arthrobotrys sp. C) Nematodos capturados en redes adhesivas del hongo Arthrobotrys sp. 

En este estudio se ha demostrado la eficiencia de los hongos asexuales en la producción de hifas modificadas y especializadas para atrapar nematodos. Estos organismos pueden detectar a sus presas y después formar sus estructuras de captura (^{Yang et al., 2020}). Este comportamiento de la morfogénesis de las estructuras de captura se puede observar en condiciones de escasez de nutrientes y en presencia de los nematodos (^{Wang et al., 2019}). Adicional, se han documentado la capacidad que tienen los hongos asexuales en producir compuestos orgánicos volátiles para imitar señales alimenticias y sexuales, lo que mantiene a los nematodos cerca durante el proceso de infección (^{Kassam et al., 2021}).

Como resultado de la evaluación de la actividad predadora de hongos asexuales, se cultivaron en medios de cultivos empobrecidos de nutrientes, lo que mostró una gran cantidad de formación estructuras de captura. Estos resultados concuerdan con estudios donde los hongos asexuales cultivados en medio de agar harina de maíz tienden a producir más hifas modificadas y especializadas (^{Saxena et al., 1987}) y a emplear compuestos orgánicos volátiles para potenciar la captura hacia los nematodos (^{Lin & Hsueh, 2021}), haciendo que las hifas modificadas se forman principalmente alrededor de los nematodos capturados (^{Dávila & Hío, 2005}).