INTRODUCCIÓN

La resistencia a los antimicrobianos por parte de microorganismos continúa siendo una amenaza creciente para la salud pública mundial al ser responsables de muchas infecciones graves en los hospitales ¹. Así la emergencia de enterobacterias productoras de carbapenemasas (KPC) representan un gran problema por ser uno de los mecanismos enzimáticos que hidroliza a la mayor parte de los antibióticos betalactámicos, entre ellos los carbapenémicos que constituyen la última línea de la familia de los betalactámicos ^2,3.

La detección de carbapenemasas es un reto debido a que su detección fenotípica convencional no es fácil para los laboratorios de Microbiología, ya que los puntos de corte clínicos no son útiles, y pueden aparecer como sensibles en el antibiograma, más aun suelen presentar diferentes niveles de expresión y aparecer como heterorresistentes, y esto hace que las pruebas de sensibilidad tengan una baja reproducibilidad, que junto a la presencia de otros mecanismos de resistencia como las betalactamasas de espectro extendido (BLEE), cefalosporinasas tipo C (AmpC) cromosómico o plasmídico pueden enmascarar la presencia de carbapenemasas ⁴. Existiendo métodos fenotípicos rápidos como el ensayo Carba NP que permite la detección de KPC en 2 horas mientras que las basadas en el crecimiento, como el disco combinado, hodge modificado (MHT) y el método de inactivación de carbapenémicos lo hacen en un tiempo más prolongado entre 18 a 24 horas ⁵. Otras pruebas como el pcr en tiempo real también han sido implementada ⁶.

Nuestro objetivo fue conocer y describir fenotípicamente las diferentes técnicas para la detección de carbapenemasas en aislamientos clínicos. Las mismas que permitirán establecer una estrategia en los laboratorios de microbiología a fin de mejorar la vigilancia y control de bacterias productoras de estos mecanismos de resistencia.

EL ESTUDIO

La identificación y determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) en Klebsiella pneumoniae fue realizada en el equipo automatizado vitex 2. Mientras que la susceptibilidad por disco difusión se realizó siguiendo las recomendaciones del documento M100: 2019 del CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute) ⁷, en la que se evaluó la susceptibilidad a cefalosporinas, monobactamicos, aminoglucósidos, quinolonas y carbapenémicos como el meropenem (MEM) e imipenem (IPM). El descarte enzimático a carbapenemasa fueron evaluadas mediante las metodologías:

a) Sinergia a doble disco, empleando inhibidores como el ácido fenilborónico (APB) que predice presencia de carbapenemasas tipo KPC (IMP-APB- MEM) y el ácido etilendiamino tetraacético (EDTA), que predice presencia o ausencia de ampC en presencia de cefotaxima (CTX) y cefoxitin (FOX). En ambos casos se sembró previamente una suspensión 0.5 Mc Farland del aislamiento de K. pneumoniae en Mueller Hinton y sobre ella se colocó en la parte central los inhibidores.

b) Test de Hodge modificado (MHT) según protocolo recomendado del CLSI 2017 ⁸, donde las cepas problemas de K. pneumoniae fueron estriados en forma longitudinal sobre Mueller Hinton que previamente fue sembrado con una suspensión 0.5 Mc Farland de Escherichia coli ATCC 25932;

c)Test de inactivación del carbapenémico (mCIM) ⁷, donde los carbapenémicos fueron expuestos durante 4 horas en caldo BHI conteniendo aislamientos de K. pneumoniae y luego cada disco fue colocado sobre Mueller Hinton en la que previamente fue sembrado una suspensión 0.5 Mc Farland de Escherichia coli ATCC 25932

d) Inmunocromatografia. Un método rápido que consistió en mezclar 10 gotas de buffer Ly-A con colonias bacterianas de K. pneumoniae. De la solución preparada se agregó 3 gotas al pocillo del caset inmunocromatografico para la lectura durante 15 minutos como máximo

HALLAZGOS

En nuestra investigación comunicamos la presencia de tres aislamientos de orina y uno de sangre de K. pneumoniae productora de carbapenemasas KPC, que presentaron CMI 4 y > = 8 para el ertapenem y > = 16 µg/mL a imipenem y meropenem.

Los CMI activo la alarma para la búsqueda del perfil de susceptibilidad por disco difusión confirmándose la resistencia a cefalosporinas de tercera generación, monobactan, aminoglucósidos (Figura 1a). Mientras que el mecanismo de resistentes por el método de sinergia a doble disco presentó positividad con el disco APB (MEM-APB-IMP), clasificándose como posible carbapenemasa, también se evidencio presencia de betalactamasa tipo C por el sinergismo del EDTA con el cefoxitin (Figura 1b). los resultados del MTH, inmunocromatografia y mCIM también mostraron positividad (Figura 2).

Figura 1 Antibiograma de Klebsiella pneumoniae: a) aislamiento multirresistente y b) sinergia de doble disco con detección de KPC parte superior y AmpC parte inferior 

Figura 2 Tamizaje confirmatorio para KPC: a) test de hodge; b) inmunocromatografia y c) mCIM 

DISCUSIÓN

La resistencia a carbapenémicos enK. pneumoniae es una preocupación importante, debido a tres mecanismos, aislados o combinados: bombas de eflujo, pérdida de permeabilidad y producción de carbapenemasas. Siendo estas betalactamasas capaces de hidrolizar no solo carbapenemicos que en el ámbito clínico son una de las ultimas opciones terapéuticas para infecciones graves por enterobacterias sino también degradan otros β-lactámicos y su diseminación suele estar mediada por plásmidos ⁵.

Por otro lado, reportes de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos y productora de carbapenemasa denominada KPC-1 datan desde 1996 en Carolina del Norte Estados Unidos ⁹. En Sudamérica, la enzima fue reportada en Colombia como KPC 2 ¹⁰. El primer reporte de k. pneumoniae KPC en Perú fue notificado en el Hospital Nacional Arzobispo Loayza, aislado de hemocultivo de una paciente con lupus eritematoso sistémico ¹¹. Mientras que en Huancayo fue aislado en muestra de orina ². Reporte de carbapenemasas tipo Nueva Delhi Metalo beta-lactamasas (NDM), también han sido informadas ³.

La incidencia de carbapenemasas en enterobacterias es muy baja y se han descrito tres clases frente a carbapenémicos, la clase A como por ejemplo la KPC, suelen ser sensibles a la acción del ácido clavulanico y presentan una menor actividad frente a meropenem que a imipenem; la clase B como las metalo-betalactamasas (VIM o las IMP), no presentan actividad frente al aztreonam y su acción es inhibida con EDTA y el tercer tipo son de la clase D, la oxacilinasa OXA-48 ¹².

La sinergia entre carbapenémicos y ácido Clavulanico, ácido boronico o EDTA pueden ser útiles para sospechar la presencia de betalactamasas de clase A o B en enterobacterias ^13,14. Otra alternativa excelente es el test de Hodge modificado en casos de bacterias productoras de KPC ^8,15 y finalmente el método de inactivación del carbapenémico ⁷ que presenta sensibilidad y especificidad cercana al 100% demostrando su superioridad en comparación a otros métodos además de ser una alternativa costo efectiva para la detección de carbapenemasas al ser un método basado en la capacidad de la enzima carbapenemasa de hidrolizar la concentración de 10µg de Meropenem contenida en un disco de papel filtro mediante la elución del mismo en agua destilada estéril ¹⁶.

El perfil de susceptibilidad de las cuatro cepas aisladas, mostraron ser multirresistentes, no productoras de BLEE, pero sí de AmpC. Este último mecanismo hace más complicado su detección fenotípica de las KPC por el enmascaramiento que produce ⁴. El patrón descrito podría indicar que se trataría de la misma cepa circulante requiriendo la confirmación por estudios moleculares a fin de determinar si las cepas productoras de KPC corresponden al mismo clon. Sin embargo, dicha tecnología fue una limitante en nuestra realidad por lo que no se realizó.

Al realizar la lectura interpretada del antibiograma en las K. pneumoniae productoras de KPC, se acortan las opciones terapéuticas. En tal escenario la terapia combinada es una opción al usar al menos dos de los siguientes antibióticos: colistin, tigecilcina, fosfomicina; Además de los recientemente aprobados por la FDA, ceftazidima/avibactam. No encontrándose este último dentro del petitorio del Ministerio de Salud del Perú, dificultando el manejo de pacientes infectados. Por tanto, la detección rápida de los mecanismos de resistencias empleando métodos replicables, económicos y fáciles son una alternativa en el programa de control de infecciones a fin de tomar las medidas preventivas contra la diseminación de enterobacterias productoras de KPC.

Como limitación del estudio fue no contar con mayor número de casos que hubiese permitido sincerar con mayor amplitud el análisis. Recomendando prestar mucha atención en la recolección y proceso de las diferentes muestras a fin de evitar errores que pudiesen influenciar en los resultados y en el análisis de métodos comparativos.

Se concluye que los métodos fenotípicos empleados, permito la confirmación de la presencia de carbapenemasas en Klebsiella pneumoniae aislados de usuarios hospitalizados en un hospital de tercer nivel