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INTRODUCCIÓN
El asma es la enfermedad crónica infantil más común1,2, a nivel mundial, en los niños, se ha incrementado 200% en los últimos 20 años3. En Latinoamérica, el Perú se encuentra en el grupo de prevalencias intermedias con un 21,47%4. Un estudio de niños en Ica, encontró una prevalencia de 13,5% de esta enfermedad, predominando los niños menores de 5 años (39%)5. En la provincia de Chiclayo, departamento de Lambayeque, el 2017, reportó 622 casos de Asma, siendo es 52% niños menores de 11 años y para el 2018 el Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo reportó 331 casos de asma alérgica6.
La incidencia del asma aumenta conforme las comunidades adoptan formas de vida occidentales y se urbanizan7. Si bien existen diversos factores de riesgo desencadenantes como la exposición a aeroalergenos8y las infecciones virales, lo que finalmente genera esta enfermedad es la idiosincrasia de la población junto a factores ambientales como genéticos3,9-11.
Numerosos estudios demuestran que el polimorfismo V4 en el gen ADAM33 está significativamente relacionado con la susceptibilidad al asma(1,4,12-16), así como con la disminución acelerada del volumen espiratorio forzado en el primer segundo (FEV1) en la espirometría17,18; sin embargo, estas asociaciones varían según el grupo étnico(19), por ejemplo en Shangai y Shandog (China) se demostró que en poblaciones caucásicas y asiáticas el polimorfismo V4 se asoció con el asma, además en el análisis de subgrupos por fuente de los controles se encontró asociaciones significativas entre este polimorfismo y el riesgo de asma en subgrupos poblacionales y hospitalarios,14,20así mismo, en la población de Uyghur (China) se demostró que los polimorfismos T2 (AG + AA) y V4 (CG + GG) contribuyeron a una mayor susceptibilidad al Asma18. En el noreste de Irán, Kamiri M., encontró asociaciones entre los polimorfismos del alelo C del T1 con pacientes asmáticos graves y el alelo G del nucleótido V4 con los asmáticos moderados, respectivamente (p = 0,006, p = 0,01)(8 )y en el estudio de Foley SC realizado en Canadá la expresión de ARNm de ADAM33 fue significativamente mayor en el asma moderada y grave en comparación con el asma leve (p <0,05) y los controles21. En población india se encontró que polimorfismos en F+1, ST+4, V4 y alelos mutantes se asociaron significativamente con un mayor riesgo de asma (p = 0.031 - < 0.001)22. En Caracas (Venezuela) se concluyó que el polimorfismo V4 está asociado con el asma, estando asociado el genotipo G/G a un riesgo aumentado de presentarla y C/C con un riesgo disminuido13. Sin embargo, en poblaciones asiáticas y latinoamericana los resultados son contradictorios1,15,23-26, en un metaanálisis sobre polimorfismos de un gen desintegrina y metaloproteasa 33 (ADAM33) y el riesgo de asma, se reportaron asociaciones significativas entre el asma y los polimorfismos T1, V4, F+1 y T+1 en la población general, y en el caso del análisis de subgrupos por etnia, solo se encontró un resultado positivo para los polimorfismos T1, V4, F+1 y T2 en Asia, pero no se encontraron dichas asociaciones en Europa ni América latina, concluyéndose que los polimorfismos T1, V4, F + 1, T2 y T+1 en el gen ADAM33 son factores de riesgo para el asma, especialmente en la población asiática15, aunque Zhu SF demostró ausencia de asociación para el polimorfismo del gen ADAM33 en población Mongólica25. Respecto de población latinoamericana, Denise L concluyó que el gen ADAM33 no es un factor de riesgo importante para el asma o para los fenotipos asociados con el asma en mexicanos o en Puertorriqueños26. En Colombia Vergara y col. no encontraron asociación entre la presencia de asma y los polimorfismos de alelos, genotipos y haplotipos del ADAM33; tampoco encontraron asociación en las subcategorías de los pacientes asmáticos grave, moderado, ni leve en comparación con los de control23.
Así, hasta el momento los polimorfismos del gen ADAM33 se han asociado con la presencia de asma en poblaciones caucásicas, africanas, hispanas y asiáticas; sin embargo, esta información es escasa en población mestiza e inexistente en población peruana.
Considerando que la población peruana tiene una gran riqueza étnica, además de la alta prevalencia presente en el país y el incremento continuo de esta tendencia, es interesante explorar esta asociación. Por ello, el objetivo del estudio fue determinar asociación entre la presencia del polimorfismo V4 del gen ADAM33 y asma, y describir el polimorfismo T1 en pacientes de un hospital de la región Lambayeque.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población y muestra
Se elaboró un estudio con diseño de casos y controles para el polimorfismo V4, y uno transversal descriptivo para el T1. Se compararon dos grupos en el rango de edad entre 5-17 años atendidos por consultorio externo del Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo-ESSalud (Hospital lll-1) del departamento de Lambayeque, durante el año 2019: los casos fueron pacientes diagnosticados según las directrices de Global Initiative for Asthma (GINA) 2016 y aquellos con ausencia de síntomas debido a utilización de medicamentos antiasmáticos, así mismo, se excluyeron pacientes con crisis asmáticas; los sujetos de control no presentaron diagnóstico de alguna enfermedad pulmonar crónica ni antecedentes familiares de asma. En ambos grupos, se excluyeron aquellas muestras de hisopado bucal que dejaron de ser viables.
Se realizó un muestreo aleatorio simple para la obtención de los casos y los controles (V4), y un estudio censal para T1. Para estimar el tamaño de la muestra, se calculó 23 casos y 23 controles para el polimorfismo V4, teniendo 6.375 como OR esperado25; y para el polimorfismo T1, la muestra estuvo constituida por todos los que pacientes asmáticos que aceptaron participar Se calculó con el software OpenEpi, utilizando un nivel de confianza del 95%, una potencia del 80%, una razón de controles por caso de 1. Todos los participantes firmaron un consentimiento y asentimiento informado, y el estudio se ajustó a los principios éticos de la investigación en seres humanos consignados en la Declaración de Helsinki y la Resolución 8430 de 1993 del Ministerio de Salud de Perú. Además, el estudio contó con la aprobación del Comité de Bioética de la facultad de medicina de la Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo con N° de resolución N°593-2018-USAT-FMED y el Comité de Ética Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo.
Toma de muestra y parámetros clínicos
Una vez finalizada la consulta se realizó el hisopado bucal en el mismo consultorio, a través de la invitación realizada por un médico neumólogo pediatra. La muestra de células bucales se obtuvo a partir del hisopado bucal con un hisopo estéril, que luego fue guardado en un tubo tapa rosca estéril de 15mL conteniendo 2mL de suero fisiológico. Las muestras se transportaron en un cooler con cadena de frío al Laboratorio de Investigación de la Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo, en donde se refrigeraron hasta su procesamiento.
A través de una ficha de recolección de datos se obtuvieron datos generales de los pacientes como su edad, sexo, procedencia, duración de la enfermedad, y el control del asma que se obtuvo aplicando una encuesta recomendada por el GINA que constaba de cuatro preguntas. El tiempo promedio de la toma de muestra y del llenado del cuestionario fue de 10 minutos.
Extracción del ADN genómico y genotipificación
El ADN genómico se obtuvo usando el Kit de extracción PROMEGA, siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. Los polimorfismos T1 (rs2280091) y V4 (rs2787094) del gen ADAM33 se determinaron mediante PCR. La mezcla de amplificación para un volumen final de reacción de 20 μl contenía 20 ng de ADN genómico y una concentración final de 2.5 uM de cloruro de magnesio, 200 uM de DNTPs y 1 uM de cada cebador. Se empleó el termociclador (Biorad, EEUU) bajo las siguientes condiciones de temperatura: denaturación inicial a 95°C por 5 minutos, ciclos de 95°C por 30 segundos, hibridación a 65° por 30 segundos y extensión a 72° por 30 segundos, una extensión final de 72° por 5 minutos se efectuó para posteriormente almacenar los productos de amplificación a 4°C hasta su electroforesis (Tabla 1). La electroforesis se realizó en poliacrilamida al 2%.
Técnica RFLP
Los productos de amplificación de los genes T1 con 374bp y V4 de 400bp fueron cortados con las enzimas Ncol y Pst1 respectivamente el tiempo de incubación fue de 37° por 15 horas para las dos enzimas en un volumen final de 37 ul. Los productos de restricción se observaron en gel de poliacrilamida al 2% y visualizados con transiluminador UV.
Tabla 1 Primers y programas de PCR para genotipificar ADAM3 por PCR-RFLP
| SNP ID | Gen/SNP primer | Secuencia | Programa de PCR |
|---|---|---|---|
| Rs2787094 | ADAM33 V4C/G F ADAM33 V4C/G R | 5’-ACACACAGAATGGGGGAGAG-3’ 5’-CCAGAAGCAAAGGTCACACA-3’ | 94°C 5 min; 35 ciclos, 94°C 30s, 53°C 30 s, 72°C 30 s; 72°C 5 min |
| Rs2280091 | ADAM33 T1A/G F ADAM33 T1A/G R | 5’-ACTCAAGGTGACTGGGTGCT-3’ 5’-GAGGGCATGAGGCTCACTTG-3’ | 94°C 5min; 35 ciclos, 94°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30 s; 72°C 5 min |
Análisis estadístico
Se calcularon medidas de tendencia central, especialmente medianas, y de dispersión para describir las variables cuantitativas. Las variables cualitativas se expresaron con frecuencias absolutas y relativas.
Para determinar la asociación entre el polimorfismo V4 y la presencia de asma, se empleó la aprueba de Xi-cuadrado de Pearson, y posteriormente se calculó el OR. El polimorfismo T1 se describió con frecuencias absolutas y relativas. Para todas las pruebas se empleó un nivel de confianza del 95%, y un nivel de significancia del 5% o 0,05. Para todos los análisis estadísticos se empleó el software SPSS versión 25.0 (IBM, Nueva York).
RESULTADOS
Tabla 3. Características demográficas y clínicas de casos y controles
| Variable | Casos V4 n(%) | Controles V4 n(%) | valor-p | Casos& (T1) |
|---|---|---|---|---|
| Sexo | ||||
| Masculino Femenino | 17 (65) 9 | 13 (50) 13 (50) | 15 (40) 23 (60 | |
| Edad (Med; RI) Procedencia | 8; 5-10,3 | 9; 7-11,3 | 9,5; 7-11,3 | |
| Lambayeque Tumbes Cajamarca Otros | 18 (70) 4 (15) 2 (7,5) 2 (7,5) | 21 (81) 2 (7,5) 1 (4) 2 (7,5) | 20 (53) 12 (32) 2 (5) 4 (10) | |
| Tiempo de enfermedad (Med; RI) | 3; 2 - 6,3 | - | - | 3; 1 - 5,3 |
| Tiempo enfermedad categorizado | ||||
| 1 - 5 años > 5 años < 1 año | 17 (65) 7 (27) 2 (8) | - - | - | 26 (69) 9 (24) 3 (7) |
| Control del asma | ||||
| Parcialmente controlado Bien controlado No controlado | 14 (54) 8 (31) 4 (15) | - | - | 17 (45) 16 (42) 5 (13) |
| V4 | ||||
| Negativo Positivo | 14 (54%) 12 (46%) | 18 (69%) 8 (31%) | - | |
| T1 | ||||
| Negativo Positivo | - | - | 5 (13) 33 (87) |
* n = 26 niños. Med = mediana. RI = rango intercuartílico. & = 38 pacientes
Con respecto a las variables sociodemográficas la mediana de edad global fue de 9 años (RIC: 6 - 11 años), los casos V4 tuvieron una mediana de edad de 8 (RIC: 5 - 10,3) y los controles V4 tuvieron una mediana de edad de 9 años (RIC: 7 - 11,3). La proporción de casos hombres fue de 65% y 40% para V4 y T1, respectivamente; mientras que en los controles la proporción de hombres y mujeres fue similar (50%).
El 54% de pacientes que presentaban el polimorfismo V4 tenían el asma parcialmente controlado, mientras que los pacientes que presentaban el polimorfismo T1, el 45% estaba parcialmente controlado y el 16% bien controlado. En ambos grupos solo el 15 y 13% no estaban controlados.
La mediana para el tiempo de enfermedad tanto para los casos con el polimorfismo V4 y T1 fue de 3 años (RI: 2 - 6,3 y RI: 1 - 5,3 años), respectivamente; así mismo, más de la mitad en ambos grupos (65 y 69% para V4 y T1) presentaron un tiempo de enfermedad que oscilaba entre 1 a 5 años.
Con respecto a la procedencia, ambos grupos procedían en su mayoría de Lambayeque. Con respecto al polimorfismo V4, en su mayoría tanto casos como controles no presentaron el polimorfismo, siento positivo solo en el 46% de los casos y 31% de los controles. Sin embargo, el polimorfismo estuvo presente en el 87% de casos.
Cuando se evaluó la asociación entre el polimorfismo V4 y la presencia de asma, el OR fue de 1,93 (IC95%: 0,62 - 6,00), valor p = 0,196 par la prueba de Xi-cuadrado de Pearson.
Tabla 4. Frecuencia de polimorfismoV4 según el sexo
| V4 | Femenino | Masculino | Total |
|---|---|---|---|
| Negativo | 13 | 19 | 32 |
| Positivo | 9 | 11 | 20 |
| Total | 22 | 30 | 52 |
No se encontraron diferencias respecto de la proporción de varones y mujeres con la presencia de la mutación. Respecto del total de mujeres, el 41% presentó el polimorfismo, mientras que del total de varones el 37% lo presentó.
Tabla 5. Frecuencia de polimorfismoV4 según el Control del asma
| V4 | Bien Controlado | No Contralado | Parcialmente Controlado | Total |
|---|---|---|---|---|
| Negativo (C) | 6 | 2 | 6 | 32 |
| Positivo (G) | 2 | 2 | 8 | 20 |
| Total | 8 | 4 | 14 | 52 |
La razón de casos con presencia y ausencia del factor según el tiempo de enfermedad se mantiene cercano a 1:1. Considerando la clasificación según el tipo de control del asma, la proporción de secuencias con citosina y guanina para los pacientes catalogados como “no controlados” y “parcialmente controlados” se mantuvo en 1:1, excepto para el caso de los pacientes “bien controlados”, cuya proporción de pacientes con C a G fue de 3:1.
Tabla 6. Frecuencia de polimorfismoV4 según la procedencia
| V4 | Amazonas | Cajamarca | Lambayeque | Trujillo | Tumbes | Total |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Negativo | 0 | 2 | 23 | 1 | 6 | 32 |
| Positivo | 1 | 1 | 16 | 1 | 1 | 20 |
| Total | 1 | 3 | 39 | 2 | 7 | 52 |
La razón de factores positivos a negativos fue de aprox. 1:1, excepto para Tumbes, donde la proporción de tumbesinos con la mutación es mucho más baja que la de otras regiones. Respecto del total de pacientes procedentes de Tumbes, solamente 14% presentó la mutación, mientras que en Cajamarca fue del 33%, y Lambayeque del 41%.
DISCUSIÓN
Las variaciones genéticas de ADAM33 pueden conducir a cambios anormales de las células del músculo liso y los fibroblastos, lo que da como resultado una hiperreactividad y remodelación de las vías respiratorias, que se correlaciona con el desarrollo de inflamación en la patogénesis del Asma27.
Utilizando un diseño de casos y controles no se encontró asociación de polimorfismos individuales ni en haplotipos de V4 del gen ADAM33 con el desarrollo del asma en la población pediátrica del Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo. Esto contrasta con los resultados de diversos estudios, donde se encontró que los polimorfismos de ADAM33 y varios haplotipos eran fuertemente asociados con el asma a predominio de población caucásica, asiática y venezolana8,13,16,20,21,25,27-29.
En el estudio de Van Eerdewegh y colaboradores se estratificó a los pacientes basado en la presencia de hiperreactividad bronquial, y en el presente estudio se estratificó a los pacientes según la gravedad del asma.
Se emplearon las mismas enzimas de restricción, secuencias de amplificación, entre otros, con respecto a un estudio en población venezolana, que sí encontró asociación con el polimorfismo V4 en los genotipos C/C (OR: 0,14) y G/G (OR: 2,10). Es posible que las diferencias de los resultados de asociación se deban a la heterogeneidad fenotípica13,16
Nuestros resultados sugieren que el polimorfismo V4 del gen ADAM33 no sería un gen importante para el asma ni para la gravedad del asma en nuestra población. La base genética del asma puede diferir entre grupos étnicos: se identificó que un subconjunto particular de polimorfismos del gen ADAM33 como factores de riesgo de asma en etnias caucásicas del Reino Unido y Estados Unidos14, de la misma manera se identificaron los polimorfismos V4 y T1 como factores de riesgo de asma en población venezolana11, sin embargo, esto contrasta con los resultados de un estudio realizado en población portorriqueña y mexicana en la que no se evidenció dicha asociación26.
A conocimiento de los autores, este es el primer estudio sobre análisis del polimorfismo V4 en niños latinos peruanos. Las diferencias en los factores de riesgo genéticos o ambientales pueden explicar las diferencias observadas30; sin embargo, estudios posteriores son necesarios para abarcar mayor población de otras regiones , por ejemplo, en este estudio, se encontró que los pacientes asmáticos procedentes de la región Tumbes presentaron una proporción de mutación mucho menor a la de otras regiones, solamente el 14% a comparación de Cajamarca y Lambayeque que fue del 33% y 41%, respectivamente.
Una de las variantes del ADAM33, el polimorfismo V4 estaría relacionado con el empalme del ARNm del gen, mientras que T1 está relacionado con la eliminación de un sitio de fosforilación importante para la señalización celular. Las modificaciones en la estabilidad del ARNm que afectan la cantidad de enzima secretada pueden estar involucradas con un mayor recambio celular y por ende con una mayor probabilidad de desarrollo de asma13. En un metaanálisis de 29 estudios de casos y controles se encontró asociación general entre T1 y la presencia de asma; sin embargo, cuando se analizó según etnicidad, se encontró asociación positiva para T1 en población asiática, mas no en población europea ni latinoamericana - solamente fueron analizados dos casos y controles de dos países (Brasil y Colombia)15- esto concuerda con la ausencia de asociación hallada para el polimorfismo T1 y la presencia de asma en población mejicana y portorriqueña26, sin embargo, discrepa con lo hallado en población venezolana: en el estudio de Martínez, para T1, se encontró asociación entre la presencia del diplotipo GGAA de ADAM33 (V4/T1) y un riesgo aumentado de presentar asma13.
En el presente trabajo se encontró que la frecuencia del polimorfismo T1 fue elevada en los pacientes asmáticos del Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo-ESSalud (87%), sin embargo, se recomienda estudiar la frecuencia de dicho polimorfismo también en controles, de modo que se pueda determinar el nivel de asociación. Estos resultados son de particular importancia para el Perú debido a la alta prevalencia de asma, la alta morbilidad y mortalidad en esta población2,4,6. Identificación de factores de riesgo genéticos ambientales y étnicos específicos para el asma permiten comprender los mecanismos y desarrollar terapias más eficaces y específicas para estas poblaciones.
CONCLUSIÓN
No se encontró asociación entre el polimorfimo V4 y la presencia de asma en pacientes de un hospital de Lambayeque. Los casos procedentes de tumbes presentan una proporción de mutación mucho menor a la de otras regiones, y el polimorfismo T1 se presenta con bastante frecuencia en los pacientes asmáticos del hospital Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo - ESSalud.
