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INTRODUCCIÓN
Las propiedades medicinales de las plantas han sido investigadas en los últimos años en todo el mundo, debido a su potente eficacia farmacológica sus pocos efectos secundarios y bajo costo. Las especies vegetales tienen componentes que las protegen contra infecciones microbianas o infestaciones por plagas. Estos fitoquímicos son ingredientes activos que poseen actividades terapéuticas (Shakya, 2016).
Los aceites esenciales de plantas medicinales se han utilizado tradicionalmente y de forma segura contra bacterias patógenas que causan enfermedades infecciosas en el hombre (Mohammadi et al., 2014). Las investigaciones con especies del género Clinopodium han determinado su actividad antibacteriana (Mohammadi et al., 2014) y antifúngica (Gilardoni et al., 2011).
El género Clinopodium L. (antes Satureja L.) pertenece a la sub tribu Menthinae y se caracteriza por la presencia de ácido rosmarínico, ácidos triterpénicos como el ácido oleanólico, ácido ursólico (Serrano et al., 2016) y también aceite esencial (Viturro et al., 2000).
Las infecciones por dermatofitos son producidas por hongos que invaden tejidos queratinizados en humanos, siendo la infección cutánea de mayor prevalencia en el Perú (Béjar et al., 2014) y el mundo (Pires et al., 2014; Sahoo & Mahajan, 2016; Hay, 2018). Las especies que afectan a los humanos pertenecen a los géneros Microsporum y Trichophyton (Pires et al., 2014; Sahoo & Mahajan, 2016). Estos hongos utilizan la queratina como su principal sustrato, y por esta razón la enfermedad afecta principalmente a los tejidosqueratinizados. Las enfermedades causadas por dermatofitos incluyen pie de atleta, tiña, tiña inguinal e infecciones de uñas (onicomicosis), causadas especialmente por Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes (Kaur et al., 2008).
Trichophyton rubrum es uno de los principales agentes etiológicos de las dermatofitosis, cuyo tratamiento se basa en fármacos antifúngicos, principalmente en derivados imidazólicos y alilaminas. Sin embargo, estas drogas sintéticas son bastante caras, presentan efectos adversos y tienen una acción lenta. Su uso también puede aumentar las posibilidades de recurrencia y de seleccionar cepas resistentes, en caso de que los medicamentos no se administren correctamente (Diogo et al., 2010), y tienen un alto costo (Biasi-Garbin et al., 2016), para enfrentar esta problemática, actualmente se buscan explorar nuevas alternativas terapéuticas, especialmente con plantas, de hecho, la actividad antimicrobiana de extractos y aceites esenciales de especies vegetales nativas, incluyendo su acción contra dermatofitos, ha sido reportada en todo el mundo (Soares et al., 2014). Es fundamental destacar que exhiben una gran diversidad química y actividad biológica, representando una alternativa fácilmente obtenible para tratar diversas enfermedades.
El objetivo de la presente investigación fue comprobar la actividad atimicótica del aceite esencial de Clinopodium brevicalyx sobre cepas de Trichophytum rubrum y contribuir a la generación de medicamentos a base de principios activos naturales, ofreciendo una alternativa terapéutica al alcance de la población con menos recursos económicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección del material vegetal
Un kilo hojas frescas de C. brevicalyx fueron recolectadas de los alrededores del complejo arqueológico de Sacsayhuamán, ubicado a 7,1 km de la ciudad del Cusco, a una altitud de 3690 m.s.n.m. Los ejemplares se recolectaron de laderas y zonas pedregosas, su identificación taxonómica fue realizada por el profesor Alfredo Tupayachi Herrera, adscrito al Herbario Vargas CUZ de la Escuela Profesional de Biología de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
Extracción del aceite esencial
La extracción se realizó utilizando las hojas secas (1000 g) de la especie Clinopodium brevicalyx, en un equipo de hidrodestilación usando una trampa de Clevenger. El aceite obtenido fue secado con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se conservó en un frasco oscuro con cierre hermético en refrigeración a 4°C hasta su análisis.
Determinación de la composición química del aceite esencial por Cromatografía de gases - espectrometría de masas
Se determinó la composición química del aceite esencial usando un cromatógrafo de gases modelo THERMO con una columna capilar HP-5MS (Polimetil xiloxano 19091S-133) de 30m x 0,25 mm x 0,25 µm. La temperatura inicial del horno fue de 60°C manteniéndose constante durante los primeros 3 minutos, aumentando la misma hasta alcanzar los 100°C a una velocidad de 10°C por minuto. Luego, se subió hasta 140°C a 5°C por minuto y finalmente alcanzó los 240°C a 20°C por minuto. El gas portador empleado fue Helio a un flujo constante de 1mL/min. El volumen de inyección fue de 1 µL con una disolución Split de 100/1 y una corrida de 50 minutos. Los resultados fueron comparados con la información del estándar de referencia de la base de datos de las librerías NIST 11 y FLAVOR 2L.
Actividad anti - Trichophyton rubrum in vitro del aceite esencial de C. brevicalyx
Para establecer la actividad antimicótica del aceite esencial de C. brevicalyx frente a T. rubrum, se evaluó la sensibilidad de la cepa micótica a diferentes concentraciones y se determinó la concentración mínima inhibitoria usando el método de macrodilución, según se detalla en a) y b) a continuación:
a) Evaluación de la sensibilidad de T. rubrum frente al aceite esencial de C. brevicalyx
Se usaron discos de papel filtro de 6 mm impregnados con concentraciones del 1-50% del aceite esencial disuelto en metanol, por cada concentración se emplearon 3 discos con un volumen de 10 µL cada uno.
Una vez activo el inóculo de la cepa ATCC 28188, se ajustó a la esacala 0,5 de Mc Farland en condiciones estériles, una suspensión de 100 µL de 1 x 106 UFC mL-1, se frota uniformemente en placas de agar Sabouraud usando un hisopo estéril. Luego, se colocaron los discos con las diferentes concentraciones del aceite esencial. Se incubaron en posición invertida a 30°C durante 48-72 horas. La actividad antimicótica fue evaluada por medición de los diámetros de los halos de inhibición en milímetros según el método descrito por (Nweze, et al., 2010) .
b) Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) usando el Método de macrodilución en caldo
Se usó el protocolo M38-A2 de la CLSI y se procedió según indica Robledo-Leal et al., (2012) (Robledo-Leal, et al., 2012) las diluciones usadas del aceite esencial fueron: 15,63; 31,25; 62,5; 125; 250 y 500 µL mL-1, el control positivo fue terbinafina 0,624 µg mL-1. Se preparó el inóculo de la cepa ATCC 28188 a una concentración de 1 x 106 UFC mL-1 ajustándola a la escala 0,5 de Mc Farland, se añade 1 mL del inóculo a cada tubo. Se incuba a 25°C durante 7 - 14 días. La CMI fue definida como la mínima concentración de antifúngico a la cual no se observa desarrollo del hongo, es decir no se adviert e turbidez. (Scorzoni et al., 2007) Posteriormente, se tomaron alícuotas de 5 µL de los tubos en los cuales se observó inhibición y se sembraron en medio específico libre del agente antimicótico y se valoró a través del cero crecimiento de colonias en la placa.
Desarrollo de la emulsión tópica elaborada con aceite esencial de C. brevicalyx
Para la formulación de las emulsiones tópicas se optó por agregar el aceite esencial a las concentraciones de 3,13; 6,25; 12,5; 25 y 50% en una base O/W.
Actividad anti - Trichophyton rubrum in vitro de la emulsión tópica elaborada con aceite esencial de C. brevicalyx
La actividad inhibitoria de las emulsiones tópicas frente a T. rubrum fue determinada usando el método de macrodilución en caldo (Pithayanukul, et al., 2007), usando como fármaco patrón una crema de terbinafina al 1 %.
RESULTADOS
El porcentaje de extracción del aceite esencial de las hojas secas de C. brevicalyx por hidrodestilación, fue de 1,98 ± 0,02% p/v. Sus propiedades organolépticas y fisicoquímicas se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1 Propiedades organolépticas y fisicoquímicas del aceite esencial de C. brevicaly
| Propiedades organolépticas | ||
| Olor | Mentolado persistente | |
| Color | Amarillo | |
| Aspecto | Líquido translúcido | |
| Propiedades fisicoquímicas | ||
| Densidad relativa (25°) | 0.93654 g mL-1 | |
| Índice de refracción a 20°C | 1.4625 | |
| Rotación óptica | +2°14´ | |
| pH | 6.20 | |
Las propiedades organolépticas y fisicoquímicas mostradas en la Tabla 1, son compatibles con la mayoría de los aceites esenciales de otras especies. (Bandoni, 2003).
En la Figura 1, se muestran los componentes identificados en el aceite esencial de C. brevicalyx por cromatografía de gases-espectrometría de masas, entre ellos destacan: limoneno (2,08%), Eucaliptol (5,97%), Linalol (3,17%) y timol (3,10%) y, los más abundantes son: Isomentona (44,25%), mentona (22,22%) y pulegona (8,23%).
Estos componentes mayoritarios serían los responsables de la actividad antimicótica frente a Trichophyton rubrum. Estudios han demostrado que los terpenos oxigenados,desempeñan un rol notable en la terapia antifúngica de los aceites esenciales (Soković et al., 2012).
Tabla 2 Actividad anti-Trichophyton rubrum de C. brevicalyx - método de discos de sensibilidad
| Concentración del aceite esencial | N | Halos de inhibición* |
| 50 % | 3 | 26,14 ± 0,76 |
| 25 % | 3 | 19,47 ± 0,92 |
| 15 % | 3 | 14,72 ± 2,56 |
| 10 % | 3 | 9,33 ± 2,06 |
| 5 % | 3 | 6,00 ± 0,01 |
| 3 % | 3 | 6,00 ± 0,02 |
| 2 % | 3 | 6,00 ± 0,01 |
| 1 % | 3 | 6,00 ± 0,03 |
*Halos de inhibición en mm, diámetro de cada disco 6 mm.
N: Número de repeticiones
Se reportaron las diferentes concentraciones y los halos de inhibición frente a T. rubrum, a la concentración de 15 % se presentó un halo promedio de 14,72 ± 2,56 mm, y un halo de 26,14 ± 0,76 mm a 50% (Tabla 2), lo que muestra que a mayor concentración existe mayor halo de inhibición. Otras especies relacionadas como Satureja cuneifolia demostraron también actividad antimicótica (Khoury et al., 2016).
Tabla 3 Actividad anti-Trichopyton rubrum del aceite esencial de C. brevicalyx -
| Concentración del aceite esencial (µL mL-1) | N | Observación* | Resultado |
| 15,63 | 3 | - | Turbidez |
| 31,25 | 3 | - | |
| 62,5 | 3 | - | |
| 125** | 3 | S/C | Sin Turbidez |
| 250 | 3 | S/C | |
| 500 | 3 | S/C | |
| Terbinafina 0,624 µg mL-1 | 3 | S/C |
Nota:*S/C: Sin crecimiento
En la Tabla 3, se muestran los resultados del método de macrodilución determinados por inspección visual de la inhibición del crecimiento del hongo en comparación con el tubo control según el grado de turbidez. Para corroborar los resultados se sembraron en placas Petri con agar Sabouraud dextrosa, las soluciones que no mostraron turbidez, no hubo crecimiento microbiano (s/c).
La CMI del aceite esencial según observación directa fue de 125 µL/mL. El control positivo terbinafina a la concentración de 0,624 µg/mL tampoco presentó crecimiento.
Tabla 4 Fórmula de la emulsión base O/W
| Componente | Porcentaje (%) |
|---|---|
| Ácido esteárico | 15 |
| Glicerina | 8 |
| Hidróxido de sodio | 0,7 |
| Agua estilada | 76,3 |
Para la elaboración de la formulación tópica se usaron los componentes de una emulsión O/W (Tabla 4), la cual demostró excelentes características organolépticas y fisicoquímicas, aspecto homogéneo, un olor característico al aceite esencial, de color blanco, con sensación refrescante al tacto, muy buena consistencia y textura.
A esta base se incorporó el aceite esencial de C. brevicalyx en diferentes porcentajes, hallándose los resultados de la actividad antimicótica frente a T. rubrum, presentados en la Tabla 5.
Tabla 5 Actividad anti-Trichophyton rubrum de la emulsión O/W con aceite esencial de C. brevicalyx
| Concentración del aceite esencial en la emulsión tópica | N | Observación* | Resultado |
| Blanco | 3 | - | TURBIDEZ |
| 3,13 % | 3 | - | |
| 6,25 % | 3 | - | |
| 12,5 % | 3 | S/C | SIN TURBIDEZ |
| 25 % | 3 | S/C | |
| 50 % | 3 | S/C | |
| Crema de terbinafina al 1 % | 3 | S/C |
Nota:*S/C: Sin crecimiento
En la Tabla 5, se puede apreciar que la emulsión O/W a partir de 12,5% no presenta turbidez, lo que es comparable con la crema de terbinafina al 1 %. Para corroborar los resultados se sembraron las emulsiones que no presentaron turbidez (12,5%, 25%, 50% y fármaco patrón) en placas con agar Sabouraud dextrosa, los hallazgos evidenciados mostraron que no hubo crecimiento de T. rubrum, este resultado fue observado también en el trabajo desarrollado por Guerra et al., 2004. (Guerra Ordoñez, et al., 2004).
Por lo tanto, se puede afirmar que la emulsión O/W elaborada con el aceite esencial de C. brevicalyx posee actividad anti- Trichophyton rubrum, siendo los posibles mecanismos de acción: la destrucción de la pared del hongo o la inhibición de la síntesis de ADN, RNA, proteínas y polisacáridos de las células micóticas o la reducción considerable del ergosterol.
DISCUSIÓN
Las dermatofitosis y las micosis superficiales son un significativo problema de salud pública que afecta al 20-25% de la población mundial. (Asticcioli et al., 2008) El aumento de la resistencia fúngica a los fármacos disponibles en el mercado, junto con su limitado espectro de acción, imponen la necesidad de desarrollar nuevos agentes antifúngicos. Los productos naturales son atractivos prototipos debido a su amplio espectro de actividades biológicas. (Soares et al., 2014).
Los aceites esenciales son compuestos naturales que pueden ser utilizados como tratamiento alternativo natural para el manejo de dermatofitosis (Kurita et al., 1981), en un estudio previo desarrollado por (Mahboubi & Valian, 2019) confirmaron que el aceite esencial de P. graveolens, cuyos componentes mayoritarios fueron el geraniol y citronelol, presentan actividad anti dermatofítica, por interferencia con la membrana celular de los dermatofitos, disminuyendo el contenido de ergosterol de la célula por inhibición de su biosíntesis (De Oliveira Pereira et al., 2015).
En nuestro estudio, se determinó que el aceite esencial de C. brevicalyx presenta como componentes mayoritarios a isomentona (44,24 %), mentona (22,22 %) y pulegona (8,23%), estos también se encontraron en otras investigaciones relacionadas. (Gilardoni et al., 2011;(Khoury et al., 2016; Božović et al., 2017). Este aceite presentó acción frente a T. rubrum, obteniendo una CMI de 125 μL mL-1, lo que coincide con lo encontrado por Jordá (2018) (Jordá Marín, 2018) quien evaluó la actividad antifúngica de Mentha longifolia estableciendo que ésta se debería al elevado contenido en cetonas monoterpénicas, concretamente mentona, isomentona y pulegona En otra investigación, el aceite esencial de Z. clinopodioides con alto porcentaje de pulegona (44,5%) mostró mediante la técnica de inhibición del micelio que las concentraciones de 120 y 250 ppm inhibieron el crecimiento de los micelios en alrededor del 53,5% y el 88,4% respectivamente para Trichoderma reesei (Mahboubi et al., 2018).
La emulsión tópica elaborada con el aceite esencial de C. brevicalyx presentó actividad frente a T. rubrum a partir de una concentración de 12,5%. Tadele et al. (2009), demostró eficacia antimicótica de emulsiones tópicas elaboradas con el aceite esencial de Thymus vulgaris frente a T. mentagrophytes. Para darle un valor agregado y un mayor grado de innovación, se ha planteado la utilización de los aceites esenciales en la preparación de emulsiones con el propósito de mejorar su aplicación sobre la piel. (García Delgado, et al., 2004).
Nuestros resultados, están de acuerdo con otros hallazgos de eficacia antifúngica demostrada para muchos géneros y especies pertenecientes a la familia Lamiaceae (Khoury et al., 2016). Las propiedades antibacterianas y antifúngicas de plantas del género Clinopodium fueron investigadas y la mayoría demostró tener fitoquímicos con actividad antimicrobiana (Gilardoni et al., 2011; Khoury et al., 2016).
Casi sesenta especies del género Clinopodium crecen en el trópico de América, y sólo se ha estudiado las actividades biológicas de algunos de ellos (Khoury et al., 2016), por ello consideramos relevantes los hallazgos presentados en el presente documento.
CONCLUSIÓN
El porcentaje de aceite esencial extraído de las hojas de C. brevicalyx fue de 1,98 ± 0,02%. La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas permitió identificar como componentes mayoritarios a isomentona, mentona y pulegona en concentraciones de 44,25; 22,22 y 8,23% respectivamente. Se obtuvo una CMI de 125 µL/mL para el aceite esencial y la emulsión elaborada mostró actividad contra T. rubrum a partir de una concentración de 12,5%.
