Introducción

Los brotes de las infecciones por Salmonella enterica representan un problema para la vigilancia epidemiológica y la microbiología clínica. Afecta a gran cantidad de poblaciones humanas y de animales siendo responsable de más del 99% de la salmonelosis humana (^{Lamas et al., 2018}). Es una bacteria que destaca entre otras salmonelas debido a su mayor morbilidad y mortalidad (^{Hernández et al., 2016}). Además, muchos de los casos que se reportan dan cuenta de su resistencia al tratamiento con agentes antimicrobianos, tanto en veterinaria como en salud humana (de Toro et al., 2014).

Según pruebas de laboratorio con antibióticos como: la ampicilina, cloramfenicol, estreptomicina, sulfamidas y tetraciclina (^{Junod et al., 2013}), reportan insuficiente capacidad inhibitoria, por tanto, estos fármacos resultan ineficaces para combatir la bacteria. Además, se ha comprobado que el uso frecuente de estos antibióticos, producen efectos colaterales como modificaciones persistentes en la microbiota intestinal (^{Zimmermann & Curtis, 2019}).

La multirresistencia a antibióticos de Salmonella enterica (^{Min et al., 2020}) es un problema clínico, que permanentemente reta la capacidad de los investigadores para generar nuevos agentes antimicrobianos. Este escenario genera espacios de oportunidad para buscar otras alternativas con suficiente capacidad inhibitoria y menor efecto colateral para su uso masivo.

Solanum sp. es uno de los cultivos más diversos e importantes del mundo y ofrece seguridad alimentaria y nutricional en la región andina (Fonseca et al., 2014). Es originaria del Perú, se encuentra en los Andes del sur y el altiplano (^{Contreras-Liza et al., 2019}). Cuenta con más de 4000 variedades y una gran variedad de productos derivados, en su mayoría deshidratados (Fonseca et al., 2014). Entre las variedades más importantes están: la papa seca (^{Garavito & Ernestina, 2019}), chuño negro (^{Arratea & Mamani, 2017}), tocosh (^{Velasco-Chong et al., 2020}) y tunta (Fonseca et al., 2014).

La tunta es un subproducto de la papa nativa amarga deshidratada obtenida mediante un proceso artesanal utilizando el medio natural (^{Fonseca et al., 2008}; ^{Ramos et al., 2018}; ^{Cahuana, 2002}). Se produce en la sierra sur peruana (provincias del Callao, Carabaya, Lampa, Chucuito y Azángaro; entre 3800- 4500 metros sobre el nivel del mar), las técnicas de producción han pasado de generación en generación, desde la época incaica. Se le considera un producto ancestral y un alimento nativo del Perú (^{Santos-Mendoza et al., 2018}; ^{Rodríguez M & Chambi R, 2019}). Se produce mediante técnicas de deshidratación natural, sometida a congelación e insolación indirecta, con periodos breves de fermentación en agua natural, Stipa ichu y tierra húmeda. Su tratamiento requiere de ciertas condiciones ambientales, como una humedad entre 30% - 40%, días soleados y noches frías (Ramos et al., 2018).

En 100 gramos de tunta existe: 323 Kcal; 18,10 ml de agua; 1,90 g de proteínas; 77,70 g de carbohidratos; 2,10 g de fibra; 92 mg de calcio; 54 mg de fosforo y 3,30 mg de hierro (MINSA-INS-Centro Nacional de Alimentación y Nutrición, 1996, p. 22). Razón por la cual, en zonas alto andinas del Perú, sur de Bolivia, norte de Argentina, norte de Chile y en el sur de Ecuador, se utiliza como alimento (de Haan et al., 2010). También es utilizado como insumo medicinal (^{Guidi et al., 2002}) debido a sus propiedades antibacterianas, ya que, contiene bacterias ácido láctico (LAB) (^{Ramos et al., 2018}). Por ejemplo: Enterococcus mundtii DSM 4838 T [MG031213] produce bacteriocinas antimicrobianas (^{Gómez et al., 2016}). Además, se sabe que algunas bacterias del ácido láctico tienen propiedades probióticas y se usan como alternativas para el control de la formación de biopelículas por bacterias patógenas, en la industria alimentaria (FAO/OMS, 2006).

La capacidad antibacteriana de la tunta aporta nuevas rutas del conocimiento para resolver problemas de salud en poblaciones de alta montaña vulnerables a infecciones por Salmonella. El uso de la tunta también tiene impacto en la sociedad, pues al impulsarse su consumo, se propicia el uso de suelos sur-andinos de la puna y ceja de selva. Además, puede poner en valor la calidad nutricional y capacidad antimicrobiana de sus derivados deshidratados. Se puede generar una mayor rentabilidad, lo que contribuiría al desarrollo sostenible de la economía de la zona, a la conservación de la cultura local y la biodiversidad de papas nativas.

En relación al medio ambiente, son pocas las variedades de papa que crecen en las montañas que bordean el lago Titicaca, como las papas nativas amargas, las cuales, son ideales para elaborar la tunta. Por ejemplo, la especie Solanum juzepczukii (variedades piñasa, loka, keta, ruckii, parina, parko, kuchijiphylla), Solanum cutilobum (variedades ocururi morado, ocururi blanco); y Solanum ajanhuiri (variedad ajanhuiri). Se caracterizan por su alta resistencia a temperaturas bajas de -5 °C, crecen en ambientes de alta montaña a más de 3800 metros sobre el nivel del mar (^{Cahuana, 2002}). Para la elaboración de tunta se aprovecha el clima invernal seco de junio a agosto en el sur del país, por tanto, no tiene implicancias ambientales negativas, puesto que, su elaboración es netamente artesanal y respetuosa con el medio ambiente.

Teniendo en cuenta que la tunta, cuenta con algunas propiedades antibacterianas enteropatógenas (^{Rodríguez & Evelyn, 2019}). El objetivo de la presente investigación fue comprobar el efecto antimicrobiano de la tunta sobre Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium.

Materiales y métodos

Resultados

La tabla 1 presenta los resultados obtenidos en diez repeticiones con 30 µl del extracto de tunta (24 mg de tunta). Observamos que el diámetro de los halos de inhibición (DHI) fluctúa entre 11,38 mm y 9,85 mm, con una media de 10,40 mm y una desviación estándar de 0,634 mm (Tabla 2, Foto 1). En la tabla 1 también se aprecia que con 30 µg de cloramfenicol, los DHI son nulos en las diez repeticiones, lo que pone de manifiesto la resistencia de la bacteria frente a este fármaco. Otro de los resultados que muestra la tabla 1 son los DHI con 300 µg de nitrofurantoina, con el cual, se consigue un DHI de 22,00 mm en las diez repeticiones, con una media de 22,00 mm y una desviación estándar de 0,00 mm (Tabla 2). Estos resultados ponen de manifiesto que, el microorganismo es sumamente sensible al fármaco. Finalmente, la Tabla 1 presenta los resultados del placebo cuyos DHI son nulos en los diez experimentos, lo que demuestra un nivel de sensibilidad “nulo”.

Figura 1. Halo de inhibición producido por la tunta sobre Salmonella entérica subespecie enterica serovar Typhimurium.

La tabla 3 presenta los resultados del análisis ANOVA, que permite establecer las diferencias entre los tratamientos experimentales. El análisis de la varianza entre distintos tratamientos reporta un valor p= 0,000, confirmando que existen diferencias significativas entre los efectos inhibitorios de los tratamientos antibacterianos de la tunta, cloranfenicol y la nitrofurantoina sobre la Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium.

La prueba post hoc (comparaciones múltiples) de la tabla 4, posibilita establecer que existen diferencias significativas entre los efectos antibacterianos de la tunta frente al cloramfenicol (p valor = 0,00) y la nitrofurantoina (p valor = 0,00). Así mismo, existen diferencias significativas entre los efectos antibacterianos del cloramfenicol y la nitrofurantoina (p valor = 0,00). Sin embargo, no existen diferencias significativas entre cloramfenicol y el control negativo (placebo), debido a que ambos no reportaron actividad antibacteriana en las 10 pruebas.

Discusión

La multiresistencia de la bacteria Salmonella enterica a los antibióticos es un problema de importancia en la microbiología clínica (de Toro et al., 2014). El incremento de la resistencia bacteriana a los antibióticos, motiva a desarrollar nuevos y efectivos tratamientos antibacterianos, la búsqueda de productos naturales representa una fuente rica en compuestos con actividad biológica (^{Muñoz et al., 2009}; Marquéz et al., 2009).

Las papas fermentadas y deshidratadas, son tubérculos procesados tradicionalmente en el Perú, pueden ser utilizada con fines nutricionales y curativos (^{Velasco-Chong et al., 2020}), utilizadas para el tratamiento natural de infecciones bacterianas (^{Enciso et al., 2020}). En una investigación realizada por ^{Mosso et al. (2018}) confirman que la papa fermentada, tocosh, contienen bacterias acido lácticas (BAL) como Lactobacillus sakei y Leuconostoc mesenteroides. El estudio de Heredia et al. (2015) demuestran que los Lactobacillus spp producen sustancias inhibitorias similares a las bacteriocinas (BLS), y el de Gonzales et al. (2003), que estas sustancias son péptidos activos: sakacina, y mesentericina de la clase II no lantibiótico, subclase IIa de bacteriocinas. Otros estudios, como el de ^{Trinetta et al. (2012}) informan que la sakacina actúa sobre los enlaces dentro de los peptoglicanos de la pared celular bacteriana, disipa el potencial trans membrana y el gradiente de pH, originando la ruptura de la pared celular de una manera muy intensa, y rápida. Muchos de los productos metabólicos de las BAL de papa fermentada contribuyen con la actividad antibacteriana, así como producción de aminas biogénicas y folatos (^{Jimenez et al., 2018}; Mosso et al., 2018; FAO / OMS, 2006).

La solución acuosa elaborada con la tunta rehidratada de Solanum juzepczukii presentó cierta actividad frente a Salmonella enterica a una concentración 0,8 g/ml. Usando alícuotas de 30 µl, que contienen 24 mg de extracto de tunta en cada disco, se observó una inhibición del crecimiento que permite categorizar a la bacteria como de sensibilidad límite frente al extracto, según la escala de ^{Duraffourd (Duraffourd et al.,1987}), pero hay que categorizarla como resistente según el patrón estándar del halo de inhibición para bacterias de la familia Enterobacteriaceae, elaborado con datos del National Committee for Clinical Laboratory Standards (^{Kiehlbauch,2000}). El método de difusión en placa de Kirby- ^{Bauer (Bauer, et al., 1966}) es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos (^{Cavalieri et al., 2009}).

Los controles que se pusieron en el experimento corroboran la conclusión, así, en placas sin antibiótico Salmonella enterica mostró un crecimiento normal, al igual que en presencia de 30 µg de cloramfenicol. Con 300 µg de nitrofurantoina, se obtuvo una zona de inhibición promedio de 22 mm pudiéndose categorizar a la bacteria como sumamente sensible según la escala de ^{Duraffourd (Duraffourd et al., 1987}) y sensible de acuerdo a los criterios de NCCLS. Todos los resultados se analizaron mediante ANOVA, pudiéndose establecer diferencias significativas entre los grupos.

Debido a que se ha trabajado con un extracto vegetal cuyos componentes activos se encuentran diluidos en comparación con antibióticos puros, es lógico no ver una potente actividad antimicrobiana, sin embargo, este trabajo establece una fuerte evidencia que la tunta, posee actividad antibacteriana, concretamente contra Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium. ^{Guidi et al. (2002}), así como ^{Rodríguez y Evelyn (2019}), también describen este efecto y ^{Ramos et al. (2018}), no solo identificaron poblaciones nativas de bacterias acidolácticas (BAL) en la tunta, sino que, observaron actividad antibacteriana frente a Listeria. Estableciendo que ésta se debería a los compuestos antimicrobianos producidas por algunas especies de LAB.

Es posible que la propiedad antibacteriana de la tunta, se deba a la presencia de metabolitos antimicrobianos como: ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetil, reuterina, péptidos antimicóticos y bacteriocinas de las BAL como resultado del proceso de fermentación de la papa (Heredia et al., 2015). Estudios de ^{Gómez et al. (2016}), así como, de ^{Ołdak y Zielińska (2017}) informaron que las bacteriocinas son capaces de romper la membrana celular, ocasionando trastornos en la replicación y transcripción del ADN bacteriano. Interrumpiendo la biosíntesis de peptidoglicanos y proteínas de la célula bacteriana, de este modo inhibe el crecimiento de Salmonella enterica.

En otras investigaciones (^{Gálvez et al., 2007}) comprobaron que los metabolitos secundarios producidos por las LAB tienen efecto antibacteriano en: Staphylococcus aureus, Clostridium tyrobutyricum, Listeria innocua, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus, Escherichia coli, Helicobacter pylori NCIPD 230 y Campylobacter jejuni.

En relación al efecto producido por el cloramfenicol registrado en la presente investigación, guarda relación con otros hallazgos donde se pudo comprobar que el 83% de aislamientos de Salmonella enterica fueron resistentes a los antibacterianos (^{Mateva et al., 2018}). Debido a que presentan genes que confieren resistencia frente a las moléculas de polipéptido catiónico antimicrobiano (CAMP), esto se da mediante la modificación del lipopolisacárido de la membrana celular bacteriana (^{Debroy et al., 2020}).

Prácticamente toda la diversidad de tubérculos del género Solanum se desarrollan en toda la región andina del Perú, así como sus diferentes métodos de conservación tradicional y sólo se han estudiado las actividades biológicas de unos pocos alimentos fermentados y deshidratados (^{Flores, 2013}; Fonseca et al., 2014; ^{Jiménez et al., 2018}). Por esto, las evidencias mostradas en este artículo son importantes, ya que puede poner en valor un producto artesanal local, así como llegar a constituir una alternativa de tratamiento de infecciones, en particular de Salmonela enterica subespecie enterica serovar Typhimurium.

Cabe mencionar que el experimento se limita a la capacidad del disco de sensibilidad que, soporta como máximo un volumen de 30 µl de extracto de tunta, con el cual, se consiguió in vitro un nivel de sensibilidad límite en la Salmonela enterica, usando la escala de Duraffourd. El fraccionamiento del extracto, así como, estudios de la microbiota asociada, especialmente BAL, pueden hacer que el agente con actividad antimicrobiana se pueda concentrar y ver su actividad potenciada.

Conclusiones

Se comprobó que la tunta (Solanum juzepczukii) tiene efecto antibacteriano sobre Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium, con un nivel de sensibilidad límite (escala de Duraffourd) pero no según el patrón estándar del halo de inhibición para bacterias de la familia Enterobacteriaceae, elaborado con datos del National Committee for Clinical Laboratory Standards (^{Kiehlbauch, 2000}). El halo promedio de inhibición es de 10,40 mm de DHI para una cantidad de 24 mg de tunta, en diez repeticiones técnicas del experimento.

Se ha aislado una cepa natural de Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium con resistencia a cloramfenicol.

La tunta (Solanum juzepczukii) es un producto comestible con evidencia de efecto antimicrobiano, que puede significar una alternativa importante en la generación de economías en convivencia con la diversidad biológica de los andes.