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Introducción
El cacao (Theobroma cacao L.) es el tercer cultivo más importante para los países con climas tropicales. Aunque generalmente se cree que es originario de Mesoamérica; recientes estudios señalan a la región del Alto Amazonas, de Sudamérica como la región de origen (Zarrillo et al., 2018). En el norte del Perú, se cultivan variedades de cacao que guardan alta similitud genética con el cacao silvestre (Arevalo-Gardini et al., 2019), resaltando la importancia de los Andes Amazónicos en el cultivo de este importante producto.
El cacao es uno de los productos más importantes de las poblaciones asentadas en los andes tropicales. Estudios recientes han demostrado una alta diversidad genética de cacao cultivado en el Perú (Oliva & Maicelo, 2020), reportando hasta seis grupos genéticos con elevado potencial industrial y nutricional (Mejía et al., 2021).
El producto más importante del cacao es el chocolate. Registros históricos indican que los Mayas lo consumían como una bebida a la que lo conocían como “alimento de los dioses”, esto debido a los efectos positivos que experimentaban luego de su consumo; sin embargo, no fue sino hasta la llegada de los europeos, que se difundió por el resto del mundo, quienes quedaron fascinados con este grano, de tal manera que modificaron su preparación obteniendo el chocolate tal como lo consumimos actualmente (Montagna et al., 2019).
El cacao y sus derivados, principalmente el chocolate, deben sus características organolépticas a su variedad, lugar de cultivo, practicas post cosecha y tratamiento industrial para su obtención. Normalmente los consumidores apreciaban a este producto por su calidad sensorial muy atractiva; sin embargo, en los últimos años se está poniendo más interés en su composición nutricional y su contenido de antioxidantes (Ferreira de Oliveira et al., 2021).
El chocolate es considerado un súper alimento, en especial el chocolate negro, el cual presenta un alto contenido de polifenoles; debido a su alto contenido de licor de cacao (Glicerina et al., 2016; Medina-Mendoza et al., 2021). No obstante su alta diversidad de compuestos antioxidantes, son los compuestos fenólicos los de mayor importancia en la bioactividad del chocolate (Magrone et al., 2017) por lo que su estudio se hace relevante desde cualquier enfoque.
Es sabido que el cacao es una fuente de antioxidantes y polifenoles en general, contiene entre 4 y 6% de estas sustancias, entre las que destacan los flavonoides (Urbańska & Kowalska, 2019) como la epicatequina, catequina y procianidina (Cárdenas-Mazon et al., 2018). Su composición depende directamente de la variedad y lugar de procedencia; sin embargo, otros factores como la fermentación y el secado del grano, generan la perdida de hasta un 70% de estas sustancias (Fang et al., 2020; Kumari et al., 2018). Teniendo en cuenta que para obtener el chocolate, los granos de cacao fermentado seco, son tostados a elevadas temperaturas, para desarrollar los compuestos aromáticos y sensoriales característicos de este alimento a través de la reacción de Maillard (Aydın et al., 2021) y, que los compuestos fenólicos antioxidantes se deterioran con el procesamiento, se ha evidenciado que afecta negativamente a las propiedades funcionales de cacao; es en esta etapa en donde se pierde la mayor cantidad de antioxidantes y polifenoles, debido a la exposición a temperaturas que oscilan entre los 110 y 160 °C (Di Mattia et al., 2017; Urbańska & Kowalska, 2019). Mientras más alta sea la temperatura de tueste y más prolongado el tiempo de tostado, mayor es la perdida de antioxidantes y polifenoles (Oracz & Nebesny, 2019).
Estudios preliminares han determinado que a medida que se incrementa la temperatura de tueste, se observan cambios en los carbohidratos, lípidos y compuestos fenólicos del cacao, además las modificaciones difieren en función a la variedad de cacao empleado (Oracz & Nebesny, 2019). Resultados más precisos obtuvieron Urbańska y Kowalska (2019), quienes al elaborar chocolates con granos tostados y crudos, encontraron diferencias significativas en los contenidos de polifenoles y antioxidantes.
Teniendo en cuenta que los granos de cacao sin tostar son una fuente importante de antioxidantes y polifenoles (Cárdenas-Mazon et al., 2018; Pallares et al., 2016); la sustitución parcial de licor de cacao tostado por licor de cacao obtenido de granos sin tostar (crudos) incrementará el contenido de antioxidantes en el chocolate. Por otro lado, no se ha estudiado aún a detalle cómo cambia el contenido fenólico y antioxidantes de chocolates cuando se realizan distintos niveles de incorporación de cacao crudo. Por lo tanto, el objetivo de investigación fue evaluar el cambio del contenido de antioxidantes y polifenoles totales de chocolates negros con la incorporación de cacao sin tostar.
Material y métodos
Reactivos y materiales
Los reactivos utilizados: éter de petróleo, metanol, reactivo de Folin Ciocalteu, carbonato de sodio, ácido gálico, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) y antioxidante Trolox fueron de Sigma Aldrich.
El cacao criollo en grano seco se adquirió de la Cooperativa Agropecuaria y de Servicios Múltiples APROCAM, cosechadas en junio de 2021, de parcelas de la provincia de Utcubamba, Amazonas, Perú.
Obtención el licor de cacao
Se seleccionó 1 kg de granos de cacao uniforme, libre de daño físico por insectos y materias extrañas. A continuación se procedió a realizar el tostado en una estufa (Climacell 110) durante 30 min a temperaturas entre 100 y 120 °C. Se descascarillaron tanto los granos tostados como los crudos, para separar la cáscara de los nibs y luego se trituraron con la ayuda de una licuadora doméstica (Oster). Posteriormente se realizó el conchado (45°C) por separado (granos tostados y crudos) durante 5 horas para obtener el licor de cacao (Dala-Paula et al., 2021).
Elaboración de chocolate con granos crudos
A partir de una formulación de chocolate oscuro al 70%, elaborado en base a la formulación descrita por Dala-Paula et al. (2021), con la única modificación de que no se adicionó lecitina de soja; se realizó tres sustituciones de licor de cacao tostado por crudo como se muestra en la tabla 1. Se continuó con el proceso de conchado por 7 horas, luego se hizo el temperado elevando la temperatura hasta 50°C en baño maría, se dejó reducir hasta 28°C y moldeó a 32°C en tabletas seccionadas de 50 g de peso. Se llevó a refrigeración por 10 minutos para facilitar el desmoldado.
Los chocolates se envasaron en papel aluminio y bolsas de polietileno herméticamente cerradas y se guardaron en un recipiente limpio y seco hasta su posterior análisis.
Todos los tratamientos se hicieron por triplicado.
Tabla 1 Formulación del chocolate negro al 70% con incorporación de cacao crudo.
| % cacao crudo | Cacao tostado (g) | Cacao crudo (g) | Total cacao | Manteca de cacao (g) | Azúcar (g) | Total chocolate (g) |
| 10 | 175,5 | 19,5 | 195,0 | 15,0 | 90,0 | 300 |
| 20 | 156,0 | 39,0 | 195,0 | 15,0 | 90,0 | 300 |
| 30 | 136,5 | 58,5 | 195,0 | 15,0 | 90,0 | 300 |
Desgrasado del chocolate
Para el desgrasado del chocolate se siguió el procedimiento descrito por Suazo et al. (2014) con algunas modificaciones. Para lo cual un 1 g de muestra de chocolate fue colocado en un tubo de ensayo de 10 ml, se mezcló con 5 mL de éter de petróleo agitándose durante 1 min en un equipo Vórtex (Velp. Scientifica, TX4). Seguidamente, la mezcla se centrifugó a 3000 rpm a temperatura ambiente, durante 15 min a temperatura ambiente, haciendo uso de una centrífuga PrO-Analytical. Se eliminó el sobrenadante y se recuperó el polvo de chocolate desgrasado; se dejó reposar durante 24 h en un ambiente oscuro para eliminar el solvente y evitar la degradación por la luz.
Preparación de los extractos
Para la obtención de los extractos se utilizó el método reportado por (Jonfia-Essien et al., 2008), con algunas modificaciones. Se tomó 0,25 g de muestra desgrasada, se mezcló con 12 mL de solución metanólica al 30%, se centrifugó a 3000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente, se filtró en papel (Whatman N° 40 - 2,5 µm). El sobrenadante fue almacenado en frascos ámbar con tapa en condiciones de refrigeración hasta su posterior análisis.
Determinación de contenido fenólico total
Para determinar el contenido de polifenoles totales se empleó el método espectrofotométrico de Folin Ciocalteu descrito por Pallares-Pallares et al. (2016) con algunas modificaciones. Se tomaron 400 µL del extracto y 100 µL de agua ultrapura, se añadieron 2,5 mL de Folin Ciocalteu diluido 1:10 y 2 mL de carbonato al 7,5%. Se llevó a estufa a 50°C por 5 min y se registró la absorbancia a 725 nm en espectrofotómetro UV-vis. Por otro lado se obtuvo la curva de calibración con ácido gálico y los resultados se expresan en mg de ácido gálico equivalente por gramo de materia seca. Todas las mediciones se hicieron por triplicado.
Determinación de la actividad antioxidante
A los extractos desgrasados también se les determinó la actividad antioxidante empleando el método descrito por Todorovic et al. (2015). Se tomaron 3 mL de solución DPPH (20 µL/L) y se le añadió 35 µL del extracto, se dejó reposar por 10 min en un lugar oscuro y se leyó la absorbancia a 516 nm en espectrofotómetro UV-vis (Unico). Con el antioxidante Trolox, se hizo la curva estándar para que los resultados puedan ser expresados en mmol de trolox equivalente (TE) por cada 100 g de muestra. Todas las mediciones se hicieron por triplicado.
Análisis de datos
Para determinar los cambios del contenido fenólico total y capacidad antioxidante en función del grado de incorporación de cacao crudo en la formulación de chocolate oscuro, se realizó análisis de regresión curvilínea, buscando los ajustes a modelos lineales, cuadráticos y exponenciales, con el software estadístico SPSS v.25.
Resultados
Tabla 2 Especificaciones de los tres modelos de regresión para actividad antioxidante en función del grado de incorporación de cacao crudo en la elaboración de chocolate oscuro.
| Modelo | R | R cuadrado | R cuadrado ajustado | Error estándar de la estimación |
| Cuadrático | 0,996 | 0,993 | 0,993 | 1,195 |
| Cúbico | 0,996 | 0,993 | 0,992 | 1,213 |
| Lineal | 0,996 | 0,993 | 0,993 | 1,179 |
La Tabla 2 muestra las especificaciones de los modelos de cambio de la capacidad antioxidante en función del grado de incorporación de cacao crudo en el procesamiento de chocolate oscuro. El modelo lineal explica con una elevada precisión el cambio (0,993) del contenido de compuestos antioxidantes, tal como se puede observar gráficamente en la Figura 1.
Figura 1 Modelos de regresión de la actividad antioxidante en función del grado de incorporación de cacao crudo en la elaboración de chocolate oscuro.
A medida que se incrementa la dosis de incorporación de cacao crudo, la capacidad antioxidante del chocolate, se incrementa, de tal manera que con 30 % de incorporación, se logra duplicar el contenido de compuestos antioxidantes en el producto final.
Tabla 3 Especificaciones de los tres modelos de regresión para contenido fenólico total en función del grado de incorporación de cacao crudo en la elaboración de chocolate oscuro.
| Modelo | R | R cuadrado | R cuadrado ajustado | Error estándar de la estimación |
| Cuadrático | 0,968 | 0,937 | 0,934 | 1,759 |
| Cúbico | 0,994 | 0,989 | 0,988 | 0,749 |
| Lineal | 0,920 | 0,846 | 0,842 | 2,116 |
Tal como se observa en la Tabla 3, los cambios en el contenido fenólico de los chocolates se ajustan mejor a un modelo cúbico (0,989), a diferencia de la capacidad antioxidante de los chocolates. En la Figura 2 se puede observar que con solo el 10% de inclusión de cacao crudo se duplica el contenido fenólico total del chocolate, el mismo que se mantiene cuando se duplica la cantidad de inclusión (20%) y vuelve a incrementar ligeramente cuando se eleva al 30% de incorporación.
Figura 2 Modelos de regresión del contenido fenólico total en función del grado de incorporación de cacao crudo en la elaboración de chocolate oscuro.
Tabla 4 Capacidad antioxidante y polifenoles totales de chocolate oscuro con cuatro niveles de incorporación de cacao crudo.
| Grado de incorporación (%) | Capacidad antioxidante (TE mmol.g-1 ms) | PFT (mg.g-1 ms) |
| 0 | 58,81 ± 1,78d | 16,36 ± 1,25d |
| 10 | 71,15 ± 0,89c | 28,70 ± 0,46c |
| 20 | 83,24 ± 1,28b | 30,14 ± 0,45b |
| 30 | 95,39 ± 0,55a | 34,35 ± 0,51a |
Nota. Se muestra los promedios y desviaciones estándar (n=9). Letras diferentes significan grupos estadísticamente diferentes.
Con la incorporación de grano de cacao sin tostar de hasta 30%, la capacidad antioxidante de los chocolates se incrementó desde 58,81 hasta 95,39 mmol TE.g-1 ms y el contenido de polifenoles totales de 16,36 hasta 34,35 mg AGE.g-1 ms (Figura 4).
Discusión
A medida que se incorpora más cacao crudo a la fórmula de chocolate, aumenta también significativamente el contenido de polifenoles y capacidad antioxidante. Debido a que durante el tostado los granos de cacao son sometidos a altas temperaturas (100-120 °C), deteriorando los compuestos fenólicos presentes (Stanley et al., 2018). Al respecto, Żyżelewicz et al. (2016) encontraron que mientras más altas son las temperaturas de tostado de las almendras de cacao, mayor es la pérdida de su contenido bioactivo; reduciendo el contenido de epicatequina, epigalocatequina, prociadininas, tetrámero de cinamtanina presentes en el grano sin tostar. Por lo que la incorporación de granos de cacao sin tostar (Oracz & Nebesny, 2019), repone en parte el contenido de compuestos bioactivos al licor para la obtención de chocolate.
De maneara análoga, la capacidad antioxidante del chocolate aumenta de forma lineal (Figura 1) cuando se incorpora cacao sin tostar; sin embargo, el cambio en el contenido de polifenoles totales se ajusta mejor a un modelo cúbico. Con 10% de incorporación, se logra duplicar el contenido fenólico y con dosis de 20 y 30% la razón de cambio se reduce (Figura 2); esto podría deberse a que aunque los polifenoles son los principales antioxidantes del cacao (Vásquez-Ovando et al., 2016), también están presentes otras sustancias antioxidantes entre ellas, metilxatinas como la teobromina y en menor cantidad la cafeína (Katz et al., 2011); también podría deberse a que a mayor cantidad de cacao crudo incorporado, parte de los compuestos antioxidantes de éste sufre deterioro (Di Mattia et al., 2017). Adicionalmente, se debe tener en cuenta que los ácidos grasos, componentes mayoritarios del cacao (Oliva-Cruz et al., 2021), también tienen propiedad antioxidante (Gustinelli et al., 2018) y podrían verse afectados por las condiciones de proceso.
Los chocolates obtenidos en esta investigación, tuvieron valores superiores de compuestos fenólicos (34,35 mg AGE.g-1) a los reportados por Urbańska y Kowalska (2019) quienes reportaron un contenido de 32,13 mg AGE por cada gramo de chocolate con cacao sin tostar de Perú. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el grado de aceptación sensorial podría verse disminuido, conforme reportan Cempaka (2021) para chocolates con la incorporación de cacao sin fermentar. Sin embargo, los resultados son de gran utilidad para los desarrolladores de chocolates bioactivos con propiedades beneficiosas en la salud, conforme ha sido demostrado en trabajos previos (Magrone et al., 2017).
Siguiendo los lineamientos descritos por Escobar-Mamani et al. (2020), los resultados aportan de manera significativa al desarrollo tecnológico sobre el aprovechamiento de un recurso oriundo de los andes amazónicos (Motamayor et al., 2008), que puede considerarse montaña conforme lo detallado por Haller y Branca (2020), que básicamente es exportado como materia prima.
La incorporación de cacao crudo al proceso de elaboración de chocolate oscuro, es una técnica novedosa que junto a técnicas de adición de extractos ricos en fenoles (Martini et al., 2018), son las alternativas más valoradas para la elaboración de chocolates con elevado potencial bioactivo teniendo en cuenta además que el cacao producido en la región Amazonas, tiene bajo contenido de grasa (Mejía et al., 2021) y elevado contenido fenólico.
Conclusión
La adición del cacao crudo al chocolate aumenta significativamente su contenido de antioxidantes, siendo el tratamiento 3 (adición del 30% de cacao crudo) el que presento la mayor cantidad de estas sustancias; sin embargo, los polifenoles aumentaron considerablemente con la adición del 10% del cacao crudo y luego la razón de crecimiento se reduce, por lo que con la incorporación de hasta el 10% de cacao crudo al final del proceso de conchado, se logra obtener chocolates oscuros con elevada contenido fenólico y alta capacidad antioxidante.
Este trabajo, permite conocer el grado de incremento del contenido de compuestos bioactivos en chocolate oscuro mediante la incorporación de cacao crudo en el proceso. Información fundamental en el desarrollo de nuevos productos con elevado potencial funcional, cuya demanda se encuentra en constan te crecimiento.
Además, el conocimiento generado permitirá fortalecer el desarrollo de tecnologías de aprovechamiento industrial del cacao nativo producido en los Andes Amazónicos del Perú.
