INTRODUCCIÓN
Los residuos lignocelulósicos agroindustriales, son definidos como aquellos residuos o subproductos de cultivos cosechados y que posteriormente han pasado por un proceso de modificación o procesamiento en industrias conserveras (Lázaro & Arauso, 2004).
Los materiales lignocelulósicos se componen de lignina, hemicelulosa, y celulosa. La celulosa está compuesta de largas cadenas de moléculas de glucosa, unidas por enlaces β 1-4 glucosídicos, los cuales hacen que la cadena sea recta y de un número de polimerización mayor de 1000 y dependiendo del origen hasta 10,000 a 20,000 (Han, 2008). Esta estructura y la encapsulación de la lignina de las fibras de celulosa hace más difícil hidrolizar las moléculas de este material si se compara con el almidón (García, Quintero, & López, 2007). La hemicelulosa también se compone de largas cadenas, pero a diferencia de la celulosa contiene pentosas, la composición exacta de la hemicelulosa depende de la fuente del material celulósico.
Dentro de los organismos capaces de aprovechar estos materiales encontramos a los hongos que degradan la celulosa y lignina de troncos a través de enzimas que secretan al medio en el que crecen obteniendo así sus nutrientes (Garzón & Cuervo, 2008), en este grupo encontramos a Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum que usan como sustrato para su producción diversos residuos lignocelulósicos (Garcés et al., 2006).
Las especies del género Trichoderma y Chaetomium agrupan especies lignocelulolíticas o ligninolíticas, cuyo sistema enzimático es capaz oxidar e hidrolizar enlaces de la lignina y la celulosa liberando las moléculas de glucosa y dejándolas libres para ser utilizadas por los microorganismos capaces de fermentarla (Calvo, 2005).
Actualmente se considera que los residuos lignocelulósicos son compuestos orgánicos que pueden ser reinvertidos en el ciclo productivo de las empresas que los generan si se sigue un manejo sustentable de los mismos; mediante el compostaje generando biofertilizantes o de la forma más rápida utilizándolos como fuente de alimentos para los animales (Lázaro & Arauso, 2004).
Este patrón de utilización de los residuos contribuye con el mejoramiento ambiental, a través de la reducción de los índices de contaminación de algunos ecosistemas que se afectan por el arrojo de ciertos residuos orgánicos que modifican las condiciones físico - ambientales del entorno animal y vegetal, generando desequilibrio en su cadena trófica (Torres, 2000).
A inicios de la década de los 90, surgió en la región La Libertad, lo que se conoce como la "Revolución Verde", especialmente en los valles de Chao, Moche y Virú del departamento (=región) de La Libertad, en donde se marca un hito en la agricultura con una producción agrícola en crecimiento continuo, elevando exitosamente los rendimientos unitarios de los principales cultivos alimenticios y poniendo especial énfasis en los cultivos de agro exportación como el espárrago y el maíz, al cual luego le seguirían diversos cultivos como la alcachofa, pimiento piquillo entre otros. Los productos obtenidos después de la cosecha pasan a un posterior procesamiento en las fábricas conserveras generando durante el proceso los llamados residuos agroindustriales (Instituto Peruano del Espárrago, 2004).
Como parte del proceso de pelado de espárrago en las plantas conserveras, se obtiene la peladilla lo que constituye aproximadamente el 25% en peso del espárrago adquirido. Una planta conservera de mediana infraestructura, procesa al día 60 TM de espárrago y desecha 15 TM de "peladilla"; este subproducto crudo es usado como alimento al ganado, sin embargo es necesario antes enriquecer el producto adicionándole proteínas.
Asimismo, el cultivo de alcachofa, maíz y pimiento piquillo generan grandes cantidades de residuos. Sin embargo, este tipo de forraje está limitado en cuanto a su composición nutritiva y aceptación por el ganado, por lo que se debe tener en cuenta que si la alimentación está sólo basada en este tipo de recurso, el animal perderá peso (Manterola, Cerda & Mira, 1999).
Debido a esto, diversas investigaciones han estado dirigidas al establecimiento de asociaciones mixtas de hongos filamentosos y levaduras para enriquecer sustratos lignocelulósicos con proteína microbiana para emplearlos en alimentación de rumiantes. (Ferrer & Aello, 2004). Estudios realizados por Porteet al. (2003), asociando Trichoderma reeseio Chaetomium cellulolyticum con Candida lipolytica demostraron un incremento en la producción de proteína microbiana utilizando como sustrato paja de trigo y empleando el cultivo mixto de T. virid y Saccharomyces cereviseae o C. utilis sobre paja de centeno se aumentó la velocidad de hidrólisis enzimática de celulosa a glucosa y la producción de proteína microbiana. Así también el estudio realizado por Barrena (1999) utilizando peladilla de espárrago como sustrato y un cultivo mixto de Trichoderma reesei y Candida utilis logró enriquecer en 10% el contenido proteico de la misma.
Teniendo en cuenta que La Libertad es un departamento líder en la actividad agroindustrial destacando por su aporte de 11,6% al sector a nivel nacional y que debido a las políticas implantadas por el gobierno para impulsar la agroexportación y la culminación de la tercera etapa del proyecto de irrigación Chavimochic, esta actividad tenderá a crecer significativamente en las próximas décadas, la presente investigación tuvo como objetivo enriquecer proteicamente los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la Región La libertad con la asociación mixta de Trichoderma reesei, Chaetomium litycum y Candida utilis, con la finalidad de producir un alimento con un valor nutritivo mayor que el que tradicionalmente ingiere el ganado. Este proceso de reutilización de residuos lignocelulósicos a escala comercial se convierte en una alternativa económica y ecológicamente rentable tanto para las empresas del sector agroindustrial de nuestra región como para la población.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
"Brácteas" y broza de Cynara scolymus var. lorca "alcachofa" procedente de la Empresa Agroindustrial Damper SAC, ubicada en la Provincia de Virú, La Libertad- Perú. "Peladilla" y broza de Asparagus officinalis "espárrago" procedente de la Empresa Agroindustrial Yosimar SAC, ubicada en la Provincia de Trujillo, La Libertad- Perú. "Coronta" y broza de Zea maiz "maíz" procedente de la Empresa Agroindustrial Casa Grande, ubicada en la Provincia de Ascope Departamento de La Libertad- Perú. "Hojas" de Saccharum officinalis caña de azúcar procedente de la Empresa Agroindustrial Casa Grande, ubicada en la Provincia de Ascope Departamento de La Libertad- Perú. "Broza" de Capsicum annuum "pimiento" procedente de la Empresa Agroindustrial Virú S.A.C., ubicada en la Provincia de Virú Departamento de La Libertad- Perú. Trichoderma reesei de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 2414. Chaetomium cellulolyticum de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 2104. Candida utilis var. major de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 1430.
Método
Acondicionamiento de los residuos lignocelulósicos: Se colectó un aproximado de 2 kg de los principales residuos lignocelulósicos de la región La Libertad.; identificados según (Bardales, 2014). Se lavaron y posteriormente se secaron en estufa a temperatura constante 85°C/ 24 horas. Posteriormente fueron fraccionados a 1 mm de espesor (Bardales, 2009).
Pretratamiento de los sustratos: 500g de muestra se mezclaron con 2 ml/g de NaOH al 2% (p/v) y se autoclavaron a 121°C por 30 minutos a 1 ATM de presión. Seguidamente se lavaron con agua destilada y secaron en la estufa.
Acondicionamiento de los biorreactores: Se construyeron 21 biorreactores de vidrio tipo tanque aireado (León, 2006) de 1L de capacidad de 20 cm de altura por 10 cm de diámetro, con tapas y acondicionado con humidificador de aire, el cual empleó un frasco de vidrio de 250 ml de capacidad del tipo envase de mostaza, la cual llevó 50 ml de solución acuosa de NaCl al 10% (p/v). Se realizaron acoples con tubos de vidrio y mangueras de pvc de 0,64 com de diámetro (Barrena, 1999). La esterilización de todo el sistema se llevó a cabo mediante cámara UV en tres sesiones de 30 minutos cada una. (Bardales, 2009).
Suministro de aire esteril: El aire estéril fue suministrado a partir de bombas de aireación de pecera air pump 300, pasando el aire por dos frascos de solución de NaCl al 20%, esterilizando así el aire que se suministró al sistema de fermentación a razón de 60 ml/ min a cada biorreactor (Bardales, 2009). Todo el sistema fue controlado automáticamente mediante el control airbiss ABB.
Reactivación de las cepas: Se usaron cepas liofilizadas de la colección española de cultivos tipo (CECT) de Trichoderma reesei 2414, Chaetomium cellulolyticum 2104 y Candida utilis 1430; las mismas que fueron reactivadas en agar sabouraud y agar sales minerales con celulosa respectivamente. Posteriormente, fueron conservadas en refrigeración, constituyendo los cultivos stock (Barrena, 1999).
Preparación del inoculo para el bioproceso: De los cultivos stock se sembraron 15 botellas planas de 250 ml de capacidad, conteniendo 50 ml de caldo sabouraud, 5 ml para cada microorganismo de estudio a 28 °C por 10 días. Posteriormente se hicieron suspensiones de esporas, mohos y levaduras en 20 matraces de 200 ml cada uno con caldo sabouraud, con la finalidad de determinar el número de esporas/ml de la suspensión, para lo cual se utilizó la cámara de neubauer (León, 2006).
Proceso fermentativo: Los biorreactores una vez ensamblados fueron alimentados con 100 gramos de residuos lignocelulósicos previamente tratados. Asimismo, fueron humedecidos con agua destilada estéril suplementada con sulfato de amonio a 1 gramo/litro del biorreactor y pH 4.5 (Bailón, 2001). Seguidamente se suministró 100 ml de suspensión microbiana de Trichoderma reesei o Chaetomium cellulolyticum dejando actuar por 72 horas, previamente se tomó una muestra del material homogenizado para evaluar ART iniciales, nitrógeno amoniacal y biomasa microbiana. Posteriormente a las 72 horas se aplicó el inóculo de Candida utilis y se dejó actuar por 6 días. Asimismo, se realizaron conteos diarios del desarrollo de biomasa de Candida utilis para monitorear su desarrollo. Al final del mismo proceso se evaluaron los mismos parámetros (ART, nitrógeno amoniacal y biomasa de Candida utilis).
Determinación de nitrógeno: Transcurrido el tiempo de fermentación se retiró todo el contenido de los biorreactores y se secó a estufa a 85 °C por 24 horas. Posteriormente fue molido finamente en malla 80. El nitrógeno total fue determinado por el método Kjedalh, seguido de un método espectrofotométrico.
Determinación de azúcares reductores totales-ART.: Se siguió el método propuesto por Bardales (2009).
Cuantificación de biomasa de Candida utilis: Se realizó mediante el método propuesto por (Bardales, 2009; León, 2009).
Diseño experimental
Se siguió el diseño en bloques de una sola casilla, con pre test y post test para cada una de los 5 principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la región La Libertad. Asimismo, se realizaron 3 repeticiones para cada tratamiento.
Análisis estadístico
La determinación de diferencias entre tratamientos se realizó con la prueba t de student. La variación entre tratamientos se determinó mediante test de ANVA7, Tukey.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla 1, muestra los resultados promedio de los azúcares reductores totales (ART) obtenidos de la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum, a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la Región La Libertad. 2018. Durante 4 días de bioproceso. La broza de "maíz amarillo duro" es el residuo lignocelulósico del cual se obtuvo la mayor cantidad de azúcares reductores totales con un promedio de 49.3 g/L y la peladilla de espárrago el residuo del que menor cantidad de ART se puede obtener con un promedio de 5,2 g/L respectivamente. Esta tabla también indica que la cantidad de ART obtenidos a partir de los diferentes residuos lignocelulósicos evaluados aumenta a medida que se establece la asociación mixta entre Trichoderma reesei y Chaetomium cellulollitycum, debido a laacción que ejerce Trichoderma sobre la lignina y Chaetomium sobre la celulosa.
La muestra los valores de F y p del Análisis de Varianza trifactorial y unifactorial para estimar la influencia de la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum en la producción de azúcares reductores totales (ART) a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la región La Libertad, 2018.
En la Tabla 2 el análisis de varianza trifactorial realizado,muestra que existen diferencias significativas en la producción de ART en función del tipo de residuos, microorganismos y tiempo. Sin embargo, no existe acción aditiva (interacción)entre ellos con respecto a la producción de ART. Del mismo modo el análisis de varianza unidireccional ratifica las diferencias detectadas en el anava tridimensional. La agrupación de las diferencias entre niveles de cada factor.
La muestra los resultados de la Prueba de Tukey para tipificar diferencias dentro de cada factor en la producción de Azúcares Reductores Totales (ART). Los factores evaluados fueron: el tipo de residuo, el microorganismo y el tiempo del bioproceso con la finalidad de establecer diferencias estadísticamente significativas. Los resultados de la prueba muestran clara diferencia significativa entre usar broza de “maíz amarillo duro” y los otros residuos evaluados como sustrato para el bioproceso. Así también para el factor microorganismo, la asociación mixta Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum mostro evidentes diferencias significativas; mientras que para el factor tiempo evaluado en el bioproceso, 96 horas es estadísticamente diferente a 40, 60 y 20 minutos y seria el tiempo adecuado para llevar a cabo un bioproceso con la asociación mixta Chaetomium cellulolyticum y Trichoderma reesei.
Por otro lado la muestra los resultados promedio del porcentaje de proteína Total determinado por el método Kjedhal de la producción de biomasa de Candida utilis var.major 1430 obtenida de la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de La Región La Libertad. 2018, durante 24 horas de bioproceso. Se puede observar que el mayor porcentaje de proteina se obtuvo a partir del residuo lignocelulòsico broza de maiz amarillo duro con un promedio de 28,59% los resultados además se corroboran según los esatadísticos de las tablas 5 y 6 respectivamente.
La biomasa lignocelulósica es una materia prima abundante y renovable, con una estimación de una producción mundial anual de entre 10 y 50 mil millones de toneladas de materia secas, aunque sólo una pequeña parte puede ser utilizada en la práctica, incluyendo la paja de cereales, paja de trigo,cáscara de arroz, mazorcas de maíz, rastrojo de “maíz”,brácteas de “alcachofa”, “peladilla de esparrago”, bagazo de “caña de azúcar”, cáscaras de frutos secos, residuos de cosecha forestal y residuos de proceso de madera (Casanova,2018). El aprovechamiento de la biomasa lignocelulósica para la generación de productos de valor agregado a partir de sus fracciones constituyentes como la hemicelulosa y la celulosa,requiere en primera instancia la eliminación de las barreras que dificultan el acceso de catalizadores químicos o biológicos que contribuyen a su transformación, con el fin de obtener una mayor velocidad de reacción y mejores rendimientos (Casanova, 2019).
La factibilidad económica de la producción de proteína unicelular depende básicamente del uso eficiente de un sustrato barato por el microorganismo, el cual debe proceder de actividades industriales propias de la zona en donde se desea producir la proteína unicelular (Nigan, 2000), esto logra que el sustrato empleado sea de bajo costo, disponible durante todo el año y sobre todo el proceso contribuye a limpiar el medio ambiente de los desechos industriales; lo cual hace de esta actividad una alternativa económica, social y ecológica (Carter, 1996).
CONCLUSIONES
La producción de biomasa de Candida utilis var. major a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la región La Libertad se ve influenciada por la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum.
El mayor porcentaje de enriquecimiento proteico corresponde a 28.59 g determinado por el método Kjedalh y se obtuvo a partir del residuo broza de maíz amarillo duro con la asociación de mixta Trichoderma reesei, Chaetomium cellulolyticum y Candida utilis.
La asociación mixta de Trichoderma reesei, Chaetomium cellulolyticum y Candida utilis logra mejorar el contenido proteico de los residuos lignocelulósicos.