Introducción

Las "planarias" pertenecen a la clase Turbellaria y se caracterizan por ser organismos de vida libre, ser acelomados triploblásticos y poseer simetría bilateral, probablemente los más primitivos con esta simetría. La reproducción de estos animales se ve facilitada gracias a su condición hermafrodita simultánea (^{Pechenik, 2016}; ^{Myers et al., 2018}), sin embargo, es su reproducción asexual por fragmentación lo que ha llamado la atención del mundo científico. Girardia sp. (Dugesiidae) como el resto de planarias son reconocidas por su alta capacidad regenerativa debido a las células madre pluripotentes que posee y que se encuentran distribuidas en todo su organismo, por lo que son consideradas organismo modelo para el estudio de la regeneración (^{Bely, 2010}).

La capacidad presente en estos organismos genera un interés por la búsqueda continua de nuevas metodologías para hacer frente a los millones de casos anuales de aparición de heridas de diferente origen, la cual se convierte en un desafío terapéutico constante (^{Asto, 2015}). Las proteínas Wnt tienen un papel en el proceso regenerativo y homeostático, además de ser un regulador crítico de las células madre (^{Logan & Nuse, 2004}). Durante la regeneración se forma una estructura especializada llamada blastema en el sitio de daño, la cual es producto de la proliferación de un conjunto de células troncales pluripotentes, llamados neoblastos. A partir del blastema, los tejidos afectados por la injuria comienzan a formarse (^{Iannacone & Tejada, 2007}; ^{Ramírez, 2018}).

La nanociencia trae ahora consigo el empleo de diferentes nanomateriales y nanopartículas, que gracias a sus propiedades, han podido ser empleados en diversos campos de la ciencia. La nanotecnología posee una gran gama de técnicas que permiten la manipulación de la materia a escala atómica y molecular. Su importancia radica en que los materiales a escala de aproximadamente entre 1 y 100 nanómetros, llamadas nanopartículas (NPs), presentan propiedades físicas, químicas y biológicas diferentes a las que la misma materia presenta en escala mayor, característica por la cual atraen la atención de numerosos investigadores (^{Minakshi et al., 2011}; ^{Khan et al., 2014}).

En los últimos años, las investigaciones se han encaminado hacia el control de la forma y el tamaño de nanopartículas metálicas debido a sus propiedades magnéticas, catalíticas, eléctricas y ópticas de nanoestructuras metálicas para obtener materiales con propiedades novedosas. La relación existente entre sus propiedades ya sean físicas o químicas y su tamaño es lo que permiten que sean aplicadas en diferentes áreas tales como la medicina, óptica, biología, entre otros (^{Khlebtsov & Dykman, 2010}; ^{Arana, 2018}).

El cobre desempeña un papel vital ya que es considerado uno de los metales más importantes en las tecnologías modernas. Las nanopartículas de cobre (NPsCu) poseen reconocida actividad bactericida frente a ciertos organismos patógenos tales como Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella entérica, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa y otros (^{Cooner, 1995}; ^{Kamyshny et al., 2011}). Las NPsCu poseen además actividad catalizadora de reducción en la electro remediación de aguas contaminadas y catalizadores de desintoxicación de gas (^{Barrabés et al., 2006}) y actividad conductora térmica y microelectrónica (^{Jeong et al., 2008}; ^{Rengifo, 2016}).

La obtención de nanopartículas puede darse por diferentes métodos, pero son los métodos físicos los que están resultando más amigables al medio ambiente por la ausencia de sustancias no deseadas y por la alta pureza de la síntesis. Métodos como la irradiación de protones, ablación láser, deposición de vapor a vacío y métodos por radiación son capaces de producir una amplia gama de NPs metálicas con poco esfuerzo para modificar el proceso para cada tipo de material (^{Rengifo, 2016}). La ablación láser es un método físico que permite obtener nanopartículas coloidales haciendo uso de una gran variedad de disolventes (^{Díaz, 2013}).

Es importante entonces determinar el efecto de las diferentes nanopartículas metálicas sobre la capacidad regenerativa en sistemas biológicos; por lo que en la presente investigación se buscó determinar el efecto de diferentes concentraciones de NPsCu sobre la capacidad de regeneración de Girardia sp.

Material y método

Los ejemplares de Girardia sp. fueron colectados en la Zona de Conache, en el distrito Laredo, Provincia Trujillo, con coordenadas 08°06.477" S 078°56.3339" W. en las riveras de un cuerpo de agua evaluado previamente como fuente de población de planarias de agua dulce. La determinación taxonómica del género Girardia sp. se llevó a cabo en el Laboratorio de Zoología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

La obtención de las nanopartículas de cobre se realizó mediante un proceso de síntesis verde conocido como ablación láser pulsada en medios líquidos (^{Agreda & Aldama, 2016}; Aldama et al., 2018) donde se irradió con disparos de un láser pulsado Nd:YAG de longitud de onda IR de 1064 nm y 37,5 mJ/pulso a una razón de repetición de 10 Hz sobre una placa de cobre de alta pureza y de dimensiones 15x15x1 mm3 sumergida en 20 ml de agua bidestilada durante 10 minutos, obteniéndose nanopartículas esféricas de cobre con un tamaño promedio de 22 nm a una concentración de 0.900 ng/L obtenida por espectroscopia de absorción atómica (^{Rivera et al., 2016}).

El sistema biológico consistió en evaluar el tiempo de regeneración de individuo completo de cada tipo de fragmento de Girardia sp. sometido a diferentes concentraciones de NPsCu, desarrollando un diseño experimental en bloques completamente aleatorizado. Se realizaron tres tipos de corte transversal, doble transversal y longitudinal obteniéndose siete bloques: fragmento superior (bloque I), inferior (bloque II), cefálico (bloque III), medio (bloque IV), caudal (bloque V), inferior (bloque VI) y derecho (bloque VII). Dentro de cada bloque se analizó el efecto de los cuatro tratamientos (0ppm, 0.225ppm, 0.450ppm, 0.900ppm) contando diez repeticiones por tratamiento.

Los datos obtenidos se los organizó en tablas, gráficos y figuras. Se aplicó el respectivo análisis de varianza y comparación de medias.

Resultados y discusión

Con la finalidad de determinar el efecto de diferentes concentraciones de NPsCu (0 ppm; 0.225 ppm; 0.45 ppm y 0.9 ppm.) sobre la capacidad de regeneración de Girardia sp., se enfrentó los diferentes fragmentos a las diferentes concentraciones de NPsCu evaluando el tiempo de regeneración del individuo completo en horas (Fig. 1). El análisis de varianza mostró diferencias significativas tanto para los tratamientos como para los bloques.

En la Figura 1, los tiempos promedios de regeneración de los diferentes fragmentos de Girardia sp. a individuo completo muestran una disminución significativa e importante. A una mayor concentración de NPsCu se observó menor tiempo de regeneración en cada uno de los diferentes tipos de fragmento. Esto se debería a que las NPsCu estarían actuando en el complejo de regeneración de Girardia sp. de manera que el proceso de formación de individuo completo se ve acelerado, contando además con la reconocida actividad bactericida que poseen las NPsCu (^{Kamyshny et al., 2011})

Fig. 1 Tiempo en horas de formación del individuo completo a partir de diferentes fragmentos de Girardia sp. sometidos a cuatro concentraciones diferentes de nanopartículas de cobre. 

Leyenda: TAMIENTOS:Concentraciones de nanopartículas de cobre. T1: 0ppm T2: 0.225ppm T3: 0.450ppm T4: 0.9ppm BLOQUES: I: Fragmento superior II: Fragmento inferior III: Fragmento izquierdo IV: Fragmento derecho V: Fragmento cefálico VI: Fragmento medio VII: Fragmento caudal

En "planarias" (Girardia sp.), luego de la injuria, la primera etapa del proceso de regeneración, se da por contracción muscular de la zona adyacente a la herida reduciendo su superficie, luego es cubierta por una capa protectora de mucopolisacárido.

Posteriormente, las células madre, llamadas neoblastos, se activan por mecanismos poco conocidos y se acumulan en la herida donde, luego, su descendencia formará el blastema de regeneración (^{Eisenhoffer et al., 2008}; ^{Wenemoser & Reddien, 2010}; ^{Rodríguez, 2015}), acción que estaría siendo estimulada por las nanopartículas de cobre.

Si se toma en cuenta solo los promedios globales por tratamientos, se muestran reducidas pero significativas diferencias, donde el tratamiento T4 (0.9ppm NPsCu) obtuvo el menor tiempo de formación de individuo completo, con 235.60 horas en promedio frente a las 238.87 horas obtenidas por el tratamiento control (0ppm NPsCu). Si se tomase en cuenta los datos por los bloques, observamos que el tratamiento 4 (0.9ppm) en el bloque I (fragmento superior) obtuvo el tiempo más corto de formación de individuo completo, siendo este de 215.2 horas en promedio frente al testigo 220.2 horas (0ppm), resultados semejantes fueron obtenidos por ^{Arana (2018}) y ^{Ramírez (2018}) quienes emplearon nanopartículas de oro y plata respectivamente.

La reducción en el tiempo de regeneración del individuo completo por bloques empleando la mayor concentración de NPsCu (0.9ppm) nos señala que los fragmentos que contienen la parte cefálica (bloque I y III) regeneran en menor tiempo (215.2 y 221.9 horas respectivamente); a diferencia de los fragmentos por corte longitudinal (bloques VI y VII) que obtuvieron los mayores tiempos (253,0 y 256,0 horas respectivamente). Esto se debería a la presencia de los ganglios cerebrales así como una mayor parte del cordón nervioso en los fragmentos superiores, haciendo que este se vea estimulado más tempranamente a la formación de blastema frente al caso de otro tipo de fragmento.

El control de la polaridad regenerativa y del correcto posicionamiento de la diferenciación de los neoblastos, está asociada a la vía de BMP (Bone Morphogenetic Proteins), cuya función es análoga en la embriogénesis en otros animales (^{Molina et al., 2007}). De igual manera, la vía de señalización Wnt, requerida por todos los metazoos para formar el patrón antero-posterior durante la embriogénesis, juega un papel central tanto durante la regeneración y la identidad posterior (^{Adell et al., 2009}; ^{Oviedo et al., 2010}). Por lo tanto nuestros resultados se muestran interesantes para futuros estudios en otros animales de experimentación o en heridas humanas producto de quemaduras.

Teniendo en cuenta que existe una similaridad entre los procesos a nivel celular y molecular, que se da tanto en las planarias como en el ser humano, podría deducirse el efecto positivo que sería alcanzado en tejidos in vivo aplicando las diferentes concentraciones de NPsCu evaluadas en la presente investigación, pues los resultados obtenidos muestran que las NPsCu influyen de manera positiva en la formación de blastema y regeneración de los tejidos perdidos.

Conclusión

Las nanopartículas de cobre, a las concentraciones trabajadas, tienen un efecto positivo en la capacidad de regeneración de la planaria Girardia sp. (Dugesiidae) a mayor concentración de nanopartículas el tiempo de regeneración disminuye.