Introducción
En Perú, el petróleo es la principal fuente de energía y se produce más de 76 mil barriles por día con una demanda 160 mil barriles diarios; y se ha evidenciado más de 150 derrames de este hidrocarburo en el ambiente durante los últimos 15 años (Mendoza & Guerrero, 2017). Más del 50% de estos derrames fueron por actividades en refinerías de petróleo, por acciones como limpieza de tanques, separadores de agua-aceite y limpieza de conductos de crudo; sumado a la falta de una intervención normativa adecuada y oportuna, varios ecosistemas son afectados por la contaminación de petróleo y se genera una problemática ambiental y socioeconómica (Cárdenas et al., 2017).
Uno de los ecosistemas afectados por los derrames de petróleo, es el agrícola, debido al impacto negativo en el crecimiento y germinación de las plantas, así como en las comunidades microbianas responsables de la descomposición de la materia orgánica para la liberación de nutrientes y fertilidad del suelo (Xie et al., 2017). Grados & Pacheco (2016) reportaron como los derrames de petróleo en la rivera del Marañón, Amazonas, Perú, afectó la actividad agrícola de la comunidad campesina de Kukama Kukamiria.
Una alternativa para solucionar esta problemática, es la aplicación de procesos de remediación mediante el uso de microorganismos, debido a su alta efectividad, bajos costos y sinergia ambiental (Liu et al., 2020).
De acuerdo con Singh et al. (2019) Bacillus thuringiensis aumento el porcentaje de germinación Pisum sativum “arveja” y presentó la capacidad de degradación de metales pesados y compuestos xenobióticos. asociados a la contaminación por petróleo.
Existen diversas metodologías para la aplicación de microorganismos para la recuperación de los suelos contaminados con petróleo, algunos con mayor eficiencia o limitaciones que otros, dentro de estas metodologías esta la bioaumentación y bioestimulación que presentan un alto índice de efectividad (dos Santos & Maranho, 2018).
Por tanto, se conoce que existen áreas agrícolas contaminadas por petróleo, y es necesario la identificación de microorganismos con la capacidad de degradar este contaminante. Por tal motivo, el principal objetivo de esta investigación fue demostrar la biodegradación de petróleo por B. thuringiensis, también, proponer estrategias para el uso de este microorganismo como una alternativa en la recuperación de suelo agrícolas contaminados con petróleo.
Materiales y métodos
Construcción de biorreactores experi- mentales
Para determinar la biodegradación de petróleo por B. thuringiensis, se empleó cu- atro biorreactores cilíndricos con aireación lateral como los descritos por Mendoza & Guerrero (2017), con una capacidad de 2 L, provisto de cuatro deflectores de 1,2 x 8 cm en cada biorreactor, con motores de 9V que fueron regulados a 1,5 V para su funciona- miento. Los biorreactores fueron conecta- dos a un sistema de aireación previamente purificado con solución salina al 20%.
Aislamiento y selección de Bacillus thuringiensis
Para el aislamiento y selección de Bacil- lus thuringiensis se empleó el bioinsecticida marca “Superbacillus”, el procedimiento empleado fue el descrito por Soares-da-Sil- va et al. (2015) que consistió en una mezcla de 1g del bioinsecticida en 10 mL de solu- ción salina, posteriormente diluida hasta 10-6, y sometida a shock térmico a 80°C por 12 minutos y enfriada a baño helado por 5 minutos. Seguido, 100 µL de la solución fue transferida en placas de Petri con agar nutritivo y extendido con una espátula Dri- galski, las placas de Petri fueron invertidas e incubadas a 28°C por 48 horas. Las co- lonias que presentaron características mor- fológicas de Bacillus fueron inoculadas en matraces con caldo nutritivo que contenía penicilina G, y fueron incubados a 28°C por 48 horas. Las colonias que crecieron fueron observadas al microscopio mediante tinción de Wirtz y azul de Coomassie para determinar su forma bacilar, distensión del esporangio, localización y morfología de la espora correspondiente a B. thuringiensis.
Elaboración del diseño experimental
Para iniciar el diseño experimental, se elaboró el medio mínimo de sales, que se empleó como parte del medio de cultivo en los biorreactores. Tiene una composición de 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4, 0,05% NH4Cl,0,5% MnSO4, 0,01% FeSO4, 0,01% CaCl2, 0,01% ZnSO4, 10 g de Acetato de Sodio, 1g Extracto de levadura (Mishra et al., 2014).
Luego de verificar la viabilidad del cul- tivo de B. thuringiensis, se preparó el inócu- lo; del cultivo puro se tomó una alícuota, se sembró en 5 mL de caldo nutritivo a 30°C a 130 rpm por 3 horas, después se tomó un 1 mL y se transfirió en frasco de Erlenmeyer con 200 mL de caldo nutritivo, se incubo en agitación constante por 20 horas y se com- paró con el tubo Nº2 del nefelómetro de MacFarland, 6x108 UFC/mL (Ballardo et al., 2017).
Para la elaboración de los tratamien- tos, se evaluó la capacidad degradativa de tres concentraciones de petróleo Diesel II (1.5, 3, 4.5%), para lo cual, antes de cada experimento todos los biorreactores fueron sometidos a desinfección química con hipo- clorito de sodio al 5% y luego en cámara UV durante una hora. Los cuatro tratamientos fueron diseñados de la siguiente manera, Tratamiento 1 (T1): medio mínimo de sales con petróleo Diésel II al 1,5% y 50 mL del in- óculo de B. thuringiensis; Tratamiento 2 (T2): medio mínimo de sales con petróleo Diésel II al 3% y 50 mL del inóculo de B. thuring- iensis; Tratamiento 3 (T3): medio mínimo de sales con petróleo Diésel II al 4,5% y 50 mL del inóculo de B. thuringiensis; Tratamiento 4 (T4): medio mínimo de sales con petróleo Diésel II al 4,5% (Mendoza & Guerrero, 2017).
Evaluación de la biodegradación de petróleo
Para el control de la biodegradación de petróleo por B. thuringiensis, se evaluó la demanda bioquímica de oxígeno (DBO5) y crecimiento de biomasa celular. Para de- terminar el DBO5, se empleó el método de Winkler modificado por Alsterberg, desde el agregado del inóculo y cada 5 días por un periodo de 15 días (Mendoza & Guer- rero, 2017). Para determinar el crecimiento de biomasa celular, se empleó el método de recuento en placa de superficie, desde el agregado del inóculo y cada 3 días por un periodo de 15 días.
Análisis estadístico
El análisis estadístico del diseño exper- imental constó de cuatro tratamientos con tres repeticiones. La desviación estándar fue calculada mediante Microsoft Excel, para los promedios de la biomasa celular y demanda de bioquímica de oxígeno se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) y un análisis de correlación de Pearson con un nivel de significancia de ρ ≤ 0,05 medi- ante Minitab 19 Statistical Software.
Resultados y discusión
Diseño experimental
De acuerdo con Kureel et al. (2017), el limitante de los procesos de biorremedación es la lenta degradación del contaminante, por tanto, el uso de biorreactores permite diversas ventajas como el incremento de la biomasa, viabilidad y vitalidad del micro- organismo mejorando la biodegradación del contaminante. El uso de sistemas de biorreactores incrementa el potencial de biorremediación y la capacidad de tolerar mejor las concentraciones del contaminante (Singh y Fulekar, 2010).
El diseño experimental empleado es similar al descrito por Mendoza & Guerrero (2017), para determinar la biodegradación de petróleo en agua de mar por Pseudomas aeruginosa, mediante cuatro tratamientos con diferentes concentraciones de petróleo (1 y 2%) en un medio mínimo de sales en biorreactores de tanque aireado y agitado.
Aislamiento de Bacillus thuringiensis
El género Bacillus en condiciones de estrés, las células producen endoesporas ovoides entrando en un estado de latencia por largos periodos, estos mecanismos de defensa están asociado a cambios tempo- ral en la expresión de genes, la posición y formas de la espora también permite una identificación morfológica (Soares-da-Silva et al., 2015).
Para el aislamiento de B. thuringiensis, el cultivo fue sometido a estrés térmico para formación de esporas, se empleó tinción de Wirtz y azul de Coomassie para su determi- nación micro-morfológica.
Prueba de DBO5
De acuerdo con Marchut-Mikolajczyk et al. (2015), que investigaron la biodegra- dación de diésel por acción de Mucor circi- nelloides, mencionan que en el caso de pro- cesos aerobios la concentración de oxígeno en el medio es uno de los parámetros más importante porque determinan la eficiencia del proceso; la actividad respiratoria está estrictamente correlacionada con la actividad de degradación microbiana, pudiendo determinarla mediante el oxígeno consumido en presencia del contaminante.
El DBO5 se utilizó como indicador indirecto para medir la degradación de materia orgánica, el cual disminuyó en forma proporcional al petróleo residual. Los resultados promedio de DBO5 entre el Día 0 (inoculación) y el Día 15 (final del tratamiento) fueron, en el T1 de 40,41 a 6,2 mg de O2/L, T2 de 87,24 a 5,6 mg de O2/L, T3 de 72,92 a 5,8 mg de O2/L, y T4 de 12,1 a 12 mg de O2/L (Tabla 1). Lo que demostró, que el petróleo fue consumido por B. thuringiensis, la pequeña cantidad de oxígeno requerido para la oxidación de materia orgánica es debido a la presencia de una cantidad menor de materia orgánica degradable.
Aumento de biomasa celular
De acuerdo con Tao et al. (2016) la biodegradación de hidrocarburos depende de la supervivencia de los microrganismos después de la inoculación, además determinaron que Bacillus cereus puede utilizar el crudo de petróleo como única fuente de carbono y energía, evidenciado por el incremento de biomasa celular después de 7 días de inoculación.
En B. thuringiensis el crecimiento celular fue exponencial, en el día 15 de tratamiento se alcanzó los valores más elevados, en el T1 fue 21x106 UFC/mL, T2 fue 28x106 UFC/mL, T3 fue 23x106 UFC/mL (Tabla 2).
En los tratamientos T1, T2, T3 se demostró la biodegradación de petróleo por B. thuringiensis en comparación con el tratamiento control T4. El recuento microbiano después de 15 días produjo el consumo de oxígeno que necesitan las bacterias para transformar el petróleo en biomasa y dióxido de carbono.
Análisis estadístico
Se aplicó el análisis de varianza (ANOVA) en los valores obtenidos de DBO5 y biomasa celular sin encontrar una diferencia significativa entre los tratamientos T1, T2, T3, además se utilizó el análisis de correlación de Pearson entre la concentración de petróleo y biomasa celular, lo que demostró que la biomasa celular es directamente proporcional a la concentración de petróleo (p ≤ 0,05 %; r = 0,999).
Los resultados obtenidos son similares a los de Das & Mukherjee, (2007), que determinaron la eficiencia de Bacillus subtilis en la biogdegradación de petróleo, y concluyeron que existe una relación entre la disminución y concentración de petróleo con respecto a la biomasa celular, así mismo demostraron que el proceso degradativo está relacionado a la respiración celular.
Bacillus thuringiensis una alternativa para la remediación de suelo agrícola contaminado con petróleo
Dentro de las metodologías de biorremediación de suelos contaminados existen dos procesos muy empleados, la bioaumentación y bioestimulación.
La bioestimulación es la adición de materiales estimulantes, agentes de carga, nutrientes, biosurfactantes, biopolímeros o biofertilzantes para facilitar el crecimiento de microorganismos degradadores o de microbiota autóctona del suelo que favorezcan el proceso de biorremediación (Wu et al., 2016). Uno de los principales problemas con este tipo de biorremediación es la posible contaminación durante la bioestimulación y que puedan afectar el proceso de remoción (Lim et al., 2016). Por otro lado, la bioaumentación implica la adición de cultivos microbianos exógenos, autóctonos comunidades o genéticamente modificados con actividad catabólica específica que se ha adaptado y probado para degradar contaminantes o mejorar la tasa de degradación (Nwankwegu & Onwosi, 2017), sin embargo, al usar microorganismos exógenos se puede producir una interferencia entre microorganismos.
Se ha reportado grandes logros de biodegradación de petróleo y sus derivados, aplicando estas metodologías, como los expuestos por Ortega-González et al. (2015), quienes consiguieron la reducción del 100% de naftaleno, 37,87% de antraceno, 25,10% de pireno y 18,18% de fluoranteno en un periodo de 45 días.
Por tanto, en la presente investigación se demostró la biodegradación de petróleo por B. thuringiensis en biorreactores aireados; de acuerdo a lo expuesto, primero se determinó la capacidad degradativa de B. thuringiensis en un ambiente controlado, para evitar contaminación o injerencia de otro microorganismo. Para posteriormente, considerar a B. thuringiensis como una alternativa para la remediación de suelo agrícola contaminado con petróleo mediante la aplicación de técnicas como la bioaumentación y bioestimulación.
Conclusiones
Se concluyó que B. thuringiensis presenta la capacidad para la degradación de tres concentraciones de 1,5%, 3% y 4,5% de petróleo “Diésel II” en un medio mínimo de sales en biorreactores de tanque aireado y agitado. Sin encontrar una diferencia estadística significativa entre los tratamientos, pero si una relación correlacional entre la concentración de petróleo y biomasa celular.
Los autores recomiendan el desarrollo de investigaciones con B. thuringiensis aplicando técnicas como la bioaumentación y bioestimulación para la remediación de suelos con presencia de petróleo.