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Introducción
En la actualidad el mundo afronta una serie de problemas ecológicos, siendo la contaminación uno de los que causan mayor impacto a los diferentes organismos; definiéndose a ésta como el factor que causa la modificación de las características físicas, químicas y biológicas del ambiente (León, 2009).
Las pocas alternativas, desde el punto de vista económico, social y nutricional, que en la actualidad se presentan para el aprovechamiento de los residuos agroindustriales, aunado a la falta de conciencia en la protección del medio ambiente provocan que estos sean mal manejados y se conviertan en fuentes de contaminación de los recursos naturales; suelo, agua y aire. (Cabos, 2014).
Los materiales lignocelulósicos juegan un papel muy importante debido a la enorme disponibilidad de este subproducto y a las diferentes fuentes agroindustriales que lo generan. Además, debido al inminente agotamiento de los recursos petrolíferos en el mundo, es necesario encontrar tecnologías novedosas utilizando recursos renovables, por ejemplo, biomasa lignocelulósica (Bardales, 2020).
De los principales componentes de los materiales lignocelulósicos, La celulosa es uno de los biopolímeros más abundantes en la naturaleza y su biosíntesis, química y su estructura aún permanecen activos como campo de investigación (Álvarez, 2012). Tal es el caso que en las últimas décadas ha habido un creciente interés por desarrollar proyectos sostenibles basados en la química verde, lo que ha conducido a la generación de materiales celulósicos novedosos y materiales compuestos que incluyen materiales celulósicos y whiskeres de celulosa, así como también, la generación de energía por medio de la obtención del bioetanol, bioaceites o el uso integral del material lignocelulósico (Bardales, 2009). Además, después de la celulosa, la lignina es la segunda fuente renovable más abundante que existe en la naturaleza y es por esta razón que se han desarrollado usos alternativos para aprovechar este subproducto agroindustrial, tal como la generación de fibras de carbón para la industria de los materiales compuestos (Cuervo et al., 2009).
Pero para que constituya una fuente abundante y rentable de materias primas debe considerarse su aprovechamiento completo y no únicamente la de la parte azucarada, además de los compuestos y productos intermedios para maximizar el valor de la materia prima (Florián, 2014).
Debido a esto, diversas investigaciones han estado dirigidas al establecimiento de asociaciones mixtas de hongos filamentosos y levaduras para enriquecer sustratos lignocelulósicos con proteína microbiana para emplearlos en alimentación de rumiantes. Como ya es conocido algunas especies de hongos del género Trichoderma son capaces de hidrolizar la lignina mientras que el género Chaetomiun hidroliza la celulosa, liberando de esta manera a las moléculas de glucosa que pueden ser fácilmente fermentables por levaduras como Candida utilis, incrementando el valor proteico de los residuos (Canedo et al., 2016).
El proceso biotecnológico planteado en este proyecto permitirá convertir los residuos lignocelulósicos agroindustriales en fuente de alimento de alto contenido proteico para el ganado así como también disminuir los costos de alimentación del ganado en especial de rumiantes al utilizar residuos lignocelulósicos propios de nuestra región generando de esta manera las condiciones que permitan la producción, consumo y la comercialización de los mismos por las comunidades rurales lo cual redundará en un beneficio económico al adoptar esta actividad como fuente de ingreso. Por lo que se estudió la Influencia de la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum en la producción de biomasa de Candida utilis var. major a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales de la región La Libertad.
Materiales y Métodos
Material biológico
“Brácteas” de Cynara scolymus var. lorca procedente de la Empresa Agroindustrial Dámper SAC, ubicada en la Provincia de Virú Departamento de La Libertad- Perú.
“Peladilla” de Asparagus officinalis procedente de la Empresa Agroindustrial Yosimar SAC, ubicada en la Provincia de Trujillo Departamento de La Libertad- Perú.
“Coronta” de Zea maiz procedente de la Empresa Agroindustrial Casa Grande, ubicada en la Provincia de Ascope Departamento de La Libertad- Perú.
Trichoderma reesei de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 2414.
Chaetomium cellulolyticum de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 2104.
Candida utilis var. major de la Colección Española de Cultivos Tipo- C.E.C.T 1430.
Todas las cepas fueron donadas por el Dr. Carlos Alberto León Torres profesor del departamento de química biológica y fisiología animal de la facultad de ciencias biológicas
Acondicionamiento de los residuos lignocelulósicos
Se colecto 2 kg de cada uno de los principales residuos lignocelulósicos de la Región La Libertad; identificados según Florián (2015). Fueron lavadas y posteriormente secadas en estufa a temperatura constante 70°C/ 24 horas, posteriormente fueron fraccionadas a 1 mm de espesor (Bardales et al., 2009).
pretratamiento de los sustratos
500g de muestra se mezclaron con 2 ml/g de NaOH al 2% (p/v) y se autoclavó a 121°C por 30 minutos a 1 atmosfera de presión. Seguidamente se lavó con agua destilada y seco en la estufa (Bardales et al., 2009).
Acondicionamiento de los biorreactores
Se construyeron 10 biorreactores de vidrio tipo tanque aireado (León, 2009) de 1L de capacidad de 20 cm de altura por 10 cm de diámetro, con tapas de jebe microporoso y acondicionado con humidificador de aire, en el cual se empleó un frasco de vidrio de 250 ml de capacidad, la cual llevo 50 ml de solución acuosa de NaCl al 10% (p/v). Se realizaron acoples con tubos de vidrio y mangueras de PVC de 0.64 cm de diámetro (Casanova, 2019).
Suministro de aire estéril
El aire estéril fue suministrado por bombas de aireación de pecera “air pump” 300, el aire paso por dos frascos de solución de NaCl al 20%, esterilizando así el aire que se suministró al sistema de fermentación a razón de 60 ml/ min a cada biorreactor (Gil, 2021).
Reactivación de las cepas
Se usaron cepas liofilizadas de la colección española de cultivos tipo (CECT) de Trichoderma reesei 2414, Candida utilis 1430 y Chaetomium cellulolyticum 2104; las mismas que fueron reactivadas en agar sabouraud y agar sales minerales con celulosa respectivamente. (Bardales, 2020).
Preparación del inoculo para el bioproceso
De los cultivos stock se sembraron 15 botellas planas de 250 ml de capacidad, conteniendo 50 ml de caldo sabouraud, 5 ml para cada microorganismo de estudio a 28 °C por 10 días. Posteriormente se hicieron suspensiones de esporas, mohos y levaduras en 20 matraces de 200 ml cada uno con caldo sabouraud, con la finalidad de determinar el número de esporas/ml 3x 106 de la suspensión, para lo cual se utilizó la cámara de Neubauer (Casanova, 2019).
Obtención y determinación de azucares reductores totales-ART.
Una vez ensamblados los biorreactores fueron alimentados con 100gramos de cada residuo lignocelulósico. Asimismo, fueron mezclados con 630 ml de agua destilada estéril suplementada con sulfato de amonio a 1 gramo/litro del biorreactor y pH 4.5 (Gíl, 2021); seguidamente se adiciono 70 ml de suspensión microbiana a 3x106 de Trichoderma reesei, Chaetomium cellulolyticum y Trichoderma reesei más Chaetomium cellulolyticum por 5 días, previamente se tomó una muestra con lo cual se determinó los Azucares Reductores Totales a 0,20,40,60,80,96 horas del bioproceso y fue determinado mediante el método de Folin Wu, 1920.
Producción de biomasa de Candida utilis var. major
Obtenido el caldo fermentativo rico en Azucares Reductores Totales se procedió a inocular 1x106 cell/ml de Candida utilis var. major para evaluar cada 4 horas por 24 horas el desarrollo de la biomasa (Guevara et al., 2019).
Cuantificación de biomasa de Candida utilis var. major
Se realizó mediante el método propuesto por (Bardales et al., 2009; León, 2009); donde se usó el método gravimétrico y recuento en cámara de Neubauer.
Análisis estadístico
La determinación de diferencias entre bloques y tratamientos se realizará con la prueba t de student. La variación entre tratamientos se hará mediante test de ANVA7 y Tukey. Asimismo, para determinar la relación entre bloques y tratamientos se realizará un test de relación de Pearson (Beltrán, 2014).
Discusión
La producción de biomasa microbiana en el mundo ha experimentado muchos cambios durante las últimas dos décadas, se han desarrollado varios procesos para la producción de biomasa a cargo de microorganismos útiles como fuentes de proteína para alimentación, debido al valor nutritivo de la materia celular, a la rapidez del proceso y a la habilidad de algunos microorganismos de poder metabolizar azúcares de los desechos de otras industrias (Galanakis, 2012).
La Tabla 2, muestra que los factores residuos y microorganismos, influyen significativamente en la producción de biomasa de Candida útilis, pero no existe influencia aditiva de los factores. Sin embargo, en la Tabla 3, se presentan los resultados del Análisis de Varianza unifactorial, los cuales confirman los resultados hallados en la Tabla 2, con la diferencia que en la Tabla 3 se incluye al testigo, no considerado en el Análisis de Varianza bifactorial.
Tabla 2 Análisis de Varianza bifactorial para estimar su influencia en la producción de biomasa (g/L) de Candida utilis var. major 1430
Diferencias significativas con p = 0.05
Tabla 3 Análisis de Varianza unifactorial para estimar diferencias de biomasa de Candida utilis por tipos de Residuos Lignocelulosicos Agroindustriales y microorganismos.
Diferencias significativas con p = 0.05
Tabla 4 Resultados promedio del Biomasa (X), rendimiento (Y) y productividad (P) de la influencia de la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum en la producción de biomasa de Candida utilis a partir de los principales Residuos Lignocelulósicos Agroindustriales de la región La Libertad.
La biomasa neta producida, por Candida utilis. var. major aumenta progresivamente tal como se incrementa la concentración de azucares reductores totales de melaza de caña de azúcar. Similar comportamiento ocurre con la productividad, debido a que existe una buena homogenización y disponibilidad del sustrato en el medio (Estévez, 1998). Utilizando un nivel industrial el cultivo de Candida utilis var. major. Empleando melaza diluida de caña de azúcar al 2%(20 g/L) se obtuvieron rendimientos del 45%; aun un tanto lejos del rendimiento teórico 56.7% Estévez (1998), León, 2005 encontró que el rendimiento de Candida utilis var. major. Obtenido (55%) es superior a (45%).
Mientras que la Tabla 5 del Análisis de Varianza bifactorial, muestra que no existe interacción entre los factores, y que, el factor residuos influye (diferencias significativas) en el rendimiento y productividad de Candida utilis; sin embargo, el Análisis de Varianza unifactorial (Tabla 6) en el que se incorpora el testigo, muestra que los factores residuos y microorganismos, influyen en el rendimiento y productividad de Candida utilis. La tipificación de las diferencias significativas (p = 0.05) se realizó con la prueba de Tukey (Tabla 7); donde se observa que el rendimiento más alto dentro del factor residuos (4.57), se presenta en la coronta de maíz seguido de espárrago (0.40); aunque, estadísticamente, son iguales entre sí y diferentes al testigo y alcachofa (0.00), que son homogéneos. En la productividad, la coronta de maíz muestra el mayor valor seguido del testigo; pero, estadísticamente son iguales; el tercer lugar lo ocupa el espárrago y difiere del valor de alcachofa.
Tabla 5 Análisis de Varianza bifactorial para estimar la influencia de Residuos Lignocelulósicos Agroindustriales y microorganismos en el rendimiento y productividad de Candida utilis.
Diferencias significativas con p = 0.05
Tabla 6 Análisis de Varianza unifactorial para estimar diferencias de rendimiento y productividad Candida utilis dentro de Residuos Lignocelulósicos Agroindustriales y Microorganismos.
Diferencias significativas con p = 0.05
Tabla 7 Prueba de Tukey para tipificar diferencias dentro de cada factor en el promedio de Azúcares Reductores Totales inicial, final y consumida.
Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
En una investigación de producción a nivel industrial de cultivo de Candida utilis var. major., empleando melaza diluida al 2%, se han obtenido rendimientos de 45% de levadura y 92% de masa seca, teniendo en cuenta un rendimiento teórico de 56,7%, comparado con un 55% en rendimiento real que se obtuvo al trabajar con una concentración de 15 g/L de ART de melaza; así también se obtuvo en rendimiento de 56.2% a una concentración de 20 g/L. de ART de cascara de café (León, 2005; Rodríguez, 2012).
La factibilidad económica de la producción de proteína unicelular depende básicamente del uso eficiente de un sustrato barato por el microorganismo, el cual debe proceder de actividades industriales propias de la zona en donde se desea producir la proteína unicelular (Palazón, 2010), esto logra que el sustrato empleado sea de bajo costo, disponible durante todo el año y sobre todo el proceso contribuye a limpiar el medio ambiente de los desechos industriales; lo cual hace de esta actividad una alternativa económica, social y ecológica (Rodríguez et al., 2012).
Conclusiones
La asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum, influyó positivamente en la producción de biomasa de Candida utilis var. major. a partir de los principales residuos lignocelulósicos agroindustriales (“brácteas” de Cynara scolymus var. lorca, “peladilla” de Asparagus officinalis y “coronta” de Zea maiz) de la región La Libertad.
La mayor cantidad de biomasa de Proteína Unicelular fue de 9,15 g/L con un rendimiento de 55% y una Productividad de 0.30 g/L-h, a partir de 26.9 g/L de Azucares Reductores Totales extraídos de la Coronta de Zea maiz en la asociación mixta de Trichoderma reesei y Chaetomium cellulolyticum.
