Selección de los medios de cultivo

Para la adsorción de plomo por Spirulina platensis, se realizaron ensayos con dos medios de cultivo para determinar cuál es el que se adapta a mejores condiciones. El medio Zarrouk contuvo 8 g de NaHCO3, 5 g de NaCl, 0.2 g de urea, 2.5 g de NaNO3, 0.5 g de K2SO4, 0.16g de MgSO4, 0.05 g de FeSO4 7 0.052 g de K2HPO4 en un 1 litro de medio, con parámetros de temperatura de 25 a 30 °C con una intensidad lumínica de entre 1500 a 3000 lux con ciclos de luz-oscuridad de 14 h luz/10 h oscuridad y un pH 5 (^{Merchán, 2018}). El medio Hoagland contuvo 0.115 g de (NH4)2NO3, 0.003 g de H3BO3, 0.656 g Ca(NO3)2, 0.08 mg de CuSO4, 0.005g de Fe2(C4H4O6)3, 0.24 g de MgCl2, 0.3 g de KNO3 y 0.22 mg de ZnSO4 en un litro de medio, con parámetros de temperatura de 24 ±2 °C con una intensidad de 37.5 µmol1m2sec-1 y un fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad por 10 días (Ilavarasi et al., 2010). La cepa de Pseudomonas aeruginosa se cultivó en caldo CASO por 18 horas a 37°C, se ajustó la turbidez hasta una OD de entre 0.10 y 0.08, para posteriormente realizar la lectura por espectrofotometría a 620 nm (^{Justo et al., 2014}).

Inmovilización celular y adición de plomo a las muestras de estudio

La inmovilización de las células de Pseudomonas aeruginosa, Spirulina platensis y consorcio de ambos se realizó por atrapamiento en matrices poliméricas de alginato de calcio, que se obtuvo por gelificación ionotrópica de la suspensión de células en alginato goteada en una solución 100 mM de cloruro de calcio (^{Arrieta et al., 2018}).

La adición de plomo se realizó en forma de nitrato de plomo (Pb(NO3)2, durante la fase exponencial de Pseudomonas aeruginosa, Spirulina platensis y consorcio de ambos, en su estado libre e inmovilizado con alginato. Al cabo de 96 horas se tomaron muestras para calcular la concentración final del metal por espectrofotometría (^{Lee et al., 2015}).

Determinación de la concentración de clorofila “a”

La clorofila “a” fue extraída con acetona mediante filtración, posteriormente se realizó una centrifugación durante 10 minutos a 20 mil rpm. El procesamiento se extracción se repitió hasta que el sobrenadante quedó incoloro. El extracto se fracciono en una mezcla de éter de petróleo/ éter dietílico [1/1 (v/v)], la acetona se eliminó por lavado con agua destilada. El extracto se concentró en rotoevaporador a una temperatura de -30°C, luego fue lavado con abundante nitrógeno y se mantuvo a -37°C en oscuridad. La determinación de total de clorofila “a” en extracto se determinó mediante espectrofotometría a 630 nm, 645 nm y 664 nm (^{Streit et al., 2015}).

Remoción de plomo y factor de transferencia

Para determinar el factor de transferencia y porcentaje de remoción, se realizó un procedimiento similar al descrito por ^{Lee et al. (2015}). El factor de transferencia fue determinado mediante la división entre el total de metal en la planta y la concentración de metal en la solución. Para el porcentaje de remoción se empleó la siguiente ecuación:

Donde, Ci es la concentración inicial del metal en la solución y Cf es la concentración final del metal en la solución.

Análisis estadístico

Para estimar la variabilidad asociada a la investigación, se realizó un estudio comparativo mediante el análisis de varianza unidireccional de los resultados de la concentración de clorofila “a”, índice de transferencia y porcentaje de adsorción, teniendo en cuenta un nivel de significancia de p ≤ 0.05, adicionalmente, para verificar los resultados estadísticos se realizó una prueba de Tukey, mediante Minitab 19 Statistical Software (^{Lee et al., 2015}).

Medios de cultivos

Se determinó la curva de crecimiento para Spirulina platensis, cuya fase de adaptación fue en 24 horas aproximadamente, con una densidad 4.10 x 105 cel/mL en medio de cultivo Zarrouk y 4.18 x 105 en medio de cultivo Hoagland, siendo el medio Hoagland el más adecuado. Respecto a Pseudomonas aeruginosa se empleó caldo CASO y se estableció la curva de crecimiento en relación de las unidades formadoras de colonias y horas, mediante lectura de espectrofotometría a 620 nm.

La mayoría de las investigaciones relacionadas a la bioadsorción de metales pesados, se realizaron a escala de laboratorio para establecer las condiciones idóneas de crecimiento y evaluar el potencial de bioadsorción. Para Spirulina platensis es recomendable usar el medio Zarrouk, dado a que las células de las microalgas tienen generalmente una carga neta negativa en la superficie que favorece la unión de iones metálicos a los ligando de la superficie, con un tiempo de contacto mínimo de 24 horas para luego dar paso a la medición de metales removidos por la acción de Spirulina platensis (^{Merchán, 2018}). De acuerdo con ^{Bedoya-Vélez et al. (2019}), quienes evaluaron la toleración de plomo de Pseudomonas spp., recomiendan el uso de agar cetrimide para su aislamiento debido que facilita su selección, sin embargo, ^{Justo et al. (2014}), recomiendan el uso de caldo CASO debido que facilita la producción de piocina e identificación de Pseudomonas aeruginosa.

Concentración de clorofila “a”

En el día 11 de la fase exponencial, se determinó la concentración de clorofila “a” en ug/mL producida por Spirulina platensis, los datos obtenidos en estado libre son ligeramente mayores en las diferentes concentraciones de plomo respecto a los tratamientos inmovilizados con alginato (Tabla 1).

De acuerdo con ^{Blaz-Aponte y Espejo (2015}), los pigmentos fotosintéticos tienen una importancia desde el punto de vista ecofisiológico ya que informan sobre la productividad y eventos de estrés al que están sometidas las plantas y/o algas, el plomo reduce la producción de clorofila “a”, dificultando la absorción de los elementos esenciales como Mg y Fe, debido a la afinidad del plomo por los ligandos de proteínas, la degradación de la clorofila se debe al incremento de la actividad de la clorofilasa, ocasionando que la clorofila “b” se reconvierta en clorofila “a”, adicionalmente, estos pigmentos son esenciales para el desarrollo y crecimiento reduciendo el dióxido de carbono a carbohidratos que son fundamentales para el desarrollo de la planta y/o alga.

Remoción de plomo y factor de transferencia

En el tratamiento con 30 mg/L de plomo, el mayor porcentaje de remoción fue para el consorcio en estado libre con 86.5%; para el tratamiento con 20 mg/L de plomo, el mayor porcentaje de remoción fue para el consorcio en estado libre con 73.1%; para el tratamiento con 10 mg/L de plomo, el mayor porcentaje de remoción fue para el consorcio con 63.3% (Tabla 1).

Con el factor de transferencia se evaluó el potencial de Spirulina platensis y Pseudomonas aeruginosa, para captar el plomo en forma de nitrato. Para Spirulina platensis el mayor factor de transferencia fue 4.98 en estado libre. Para Pseudomonas aeruginosa el mayor factor de transferencia fue 2.47 en estado inmovilizado (Tabla 1).

Los resultados obtenidos con Spirulina platensis son similares a los obtenidos por otros autores como ^{Malakootian et al. (2016}), que evaluaron la eficiencia de microalgas para adsorción de plomo en aguas residuales, en la cual determinaron que Spirulina platensis presentó una eficiencia del 92.13% para la absorción de 2 g/L de plomo. Asimismo, de acuerdo con ^{Bedoya-Vélez et al. (2019}), que evaluaron la tolerancia al plomo de Pseudomonas spp. aislada de aguas residuales, demostró que tienen la capacidad de tolerancia al plomo en concentraciones de 500 a 2000 mg/L, además, que determinaron que no existe una diferencia significativa entre las diferentes concentraciones de plomo.

Análisis estadístico

La prueba estadística ANOVA mostró que no existe una diferencia significativa en la concentración de clorofila “a”, asimismo, no se encontró una diferencia estadística significativa en el factor de transferencia. Sin embargo, si existe una diferencia significativa el porcentaje de remoción (Tabla 2). Por tanto, se realizó la prueba de Tukey, que demostró que no existe una diferencia de las medias entre los tratamientos con Spirulina platensis, Pseudomonas aeruginosa y consorcio Spirulina con Pseudomonas (Figura 1, Figura 2).

La adsorción de metales pesados por parte de Spirulina platensis se debe las siguientes variables, por la presencia de grupos carboxilos OH-COOH, el efecto del tiempo de contacto en adsorción, dosificación de adsorbente, la concentración inicial de iones metálicos necesarios (^{Merchán, 2018}).

Entre los mecanismos reportados en la literatura de tolerancia de plomo, se destaca la biocumulación intercelular, bioadsorción y bioprecipitación, algunos estudios han reportado que la enzima ureasa influencia en la precipitación de metales pesados. La bioadsorción hace referencia a la captación pasiva de iones metálicos a través de diferentes mecanismos fisicoquímicos o metabólicos, llevados a cabo por células vivas o muertas y/o sus componentes, asimismo, ante la presencia del metal se puede generar la inducción de proteínas de unión a metales, conocidas como metalotioneínas, las cuales permiten que se dé la bioacumulación de metales tóxicos dentro de la bacteria (^{Bedoya-Vélez et al., 2019}; ^{Gabr et al., 2008}).