Zonas de ejecución y colección de material biológico

Las evaluaciones se realizaron en las poblaciones rurales cercanas a Reserva de Biosfera del Noroeste de Amotapes-Manglares (RBNAM), las muestras fueron obtenidas de las localidades de Rica playa, Pampas de Hospital, Cabuyal, La Angostura, Papayal, Isla Noblecilla y La Totora, la colecta de abejas se realizó haciendo uso de una red entomológica donde estas realizaban el pecoreo sobre flores y cercanas a la entrada de la colonia (piquera), así como directamente de las cajas racionales de pequeños meliponarios, siendo depositadas en tubos falcón de 50 ml conteniendo buffer twin al 2%, siguiendo protocolos establecidos y luego llevadas, en Criobox con GelPack al Laboratorio de Biología Molecular de la empresa INCA’BIOTEC S.A.C.

Identificación de Melipona mimética

Las muestras se desinfectaron siguiendo el protocolo, el proceso se inició seccionándole la pata trasera para abejas grande, patas y tórax para medianas y cuerpo entero para especímenes pequeños, el procedimiento utilizado fue una modificación al método del acetato de potasio, para las reacciones de PCR se utilizaron primers del gen COI, LCO1490 y HCO2198, del (^{PM 7/129 (1) DNA., 2016}), del gen 28S los primers 28s D2F y 28s D3R, así mismo del gen 16S con los primers 16SWb y 16SWa para preparar el mix usado en PCR con un volumen final de 24 μL, que contenían 19,7 μL de agua libre de nucleasas, 2,5 μL de buffer 10X, 0.5 μL de dNTP’s 10mM, 0,6 μL de cada primers: Forward 15μM, Reverse15μM y 0,1 μL de Taq DNA polymerase 5U/μL; agregándoseles a cada una 1 μL de ADN genómico (^{Josefsen et al., 2015}).

Se utilizó un termociclador TurboCycler 2 de Blue-Ray Biotech para la amplificación, realizándose un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 30 seg, con un alineamiento a 50 °C por 45 seg, y dos extensiones a 72 °C, una por 1 min y la final por 7 min.

Los productos de PCR se tiñeron con 2 µl de azul de bromofenol + 8 µl del amplicón, estos fueron migrados en gel de agarosa al 1% a 90 Voltios por 25 min y posteriormente se visualizaron bajo luz UV. Posteriormente, se visualizaron en un transluminador. UV TMW-20

Los amplicones obtenidos en la PCR, fueron secuenciados en la empresa Magrogen-EE.UU. Las secuencias obtenidas, fueron comparadas con la base de datos de GenBank del NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) para determinar mayor porcentaje de homología.

Identificación de comunidad bacteriana

Se colectaron muestras de los estados de desarrollo: huevo, larva pupa y adulto, de M. mimética de un meliponario ubicado en el distrito de Pampas de Hospital, región Tumbes, se utilizaron bolsas ziploc para llevarlas al laboratorio, en discos de cría conteniendo tubos eppendorf.

Microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo.

Las muestras biológicas fueron congeladas y depositadas por separado en tubos eppendorf de 2 ml, posteriormente fueron llevadas a cámara con UV donde se desinfectaron superficialmente adicionando etanol al 70 % por 3 min, luego se eliminó y se adicionó NaClO al 1% por 30 seg, se les enjuago 3 veces con agua destilada y esterilizada, posteriormente las muestras fueron maceradas, utilizándose una parte para la extracción de ADN (metagenómica) (^{Díaz et al., 2018}).

Microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo

Parte de las muestras maceradas, fueron agregadas por separado a 1 ml de agua destilada, se homogenizo y se tomaron 20 µl de las muestras para ser esparcidas en cajas petri conteniendo el medio de cultivo TSA, las cuales fueron incubadas por 24 horas, posteriormente purificadas y cultivadas en caldo LB por 24 horas (Díaz et al., 2018).

Extracción de ADN de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes y dependientes del medio de cultivo

Para extraer el ADN metagenómico de la microbiota intestinal mediante técnicas independientes del medio de cultivo, se tomó una parte de cada muestra macerada y se procedió con la aplicación del protocolo recomendado por el kit comercial PowerSoil® DNA Isolation Kit, (^{Josefsen et al. 2015}). Así mismo para la microbiota intestinal mediante técnicas dependientes del medio de cultivo, se usaron cepas bacterianas purificadas las cuales fueron centrifugadas a 13,000 rpm, el sobrenadante fue eliminado y el sedimento fue resuspendido en 1 ml de solución tampón TE (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA). Las bacterias fueron sometidas a una locis celular por adición de 30 µl de SDS (10%) y 3 µl de proteinasa K (37 °C, 1 hora), se añadió 100 µl de NaCl (5M) y 80 µl de CTAB/NaCl (previamente calentado a 65 °C) y se incubaron a 65 °C por 10 min. Posteriormente, se adicionó cloroformo/alcohol isoamil (24:1) y tras centrifugarse a 13,000 rpm por 5 min, se añadió 0,6 ml de isopropanol, volviéndose a centrifugar a 1,200 rpm por 5 min, se descartó al sobrenadante y al precipitado se le adicionó 1ml de etanol frío, y nuevamente se centrifugó a 12,000 rpm 5 min, se eliminó el etanol mediante secado a temperatura ambiente por 5 min, y se obtuvo los ácidos nucleicos a los cuales se les adicionaron 30 𝑢l de tampón TE y 1 µl de solución de RNAsa a 37 °C por 1 hora para eliminar el ARNs y obtener el ADN puro (^{Díaz et al., 2018} y ^{Ribière et al., 2019}).

Amplificación del gen del ADNr 16S

Se utilizaron los primers universales 27-f Forward 5'AGAGTTTGATCMTGGCTC- 3' y 1492-r Reverse 5' - TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3' (^{Belkaid et al. 2017}), para lo cual se utilizó un mix de reacción para la amplificación del gen del ADNr 16S compuesto de Buffer Taq 10X 2,5µL, MgCl₂ 25mM 2,5µL, dNTP’s 10mM 0,5µL, Taq Polimerase 5U/ µL 0,1µL, 16s ARNr F 0,6, 16s ARNr R 0,6, Agua ultra pura 16,2µL, ADN 3µL, con un volumen final 25µL. La PCR con un programa de desnaturalización inicial 94 °C en 5 min 1 ciclo, y otro por 30 seg, Hibridación 49 °C en 60 seg, Elongación de 72°C por 1 min con 35 ciclos, y la final 72 °C por 4 min por 1 ciclo y a temperatura final de conservación de 4 °C ^{(Díaz et al. 2018}).

Obtención de la secuencia parcial del gen del ADN ribosómico 16S

La secuenciación nucleotídica se realizó empleando primers internos 16S ADNr 518F y 16S ADNr 800R, las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas con el software BLAST usando la base de datos del 16S ADNr del GEN BANK y el programa MEGA 6. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information - USA).

En la comunidad bacteriana

a. Microbiota intestinal independiente de medio de cultivo

Mediante metagenómica se identificó 85 géneros de bacterias que conforman la microbiota interna del estado de huevo en M. mimetica (Tabla 1), siendo Acinetobacter sp. 17,663%, Lactobacillus sp. 13,411%, Alishewanella sp. 11,350%, Shewanella sp. 11.039% y Pseudomonas sp., 8,547%, siendo los de mayor porcentaje los 5 primeros de la tabla; en el estado de larva fueron identificados 14 géneros (Tabla 2), de los cuales Lactobacillus sp. 55,213%, Coprobacillus sp. 25,489%, Clostridium sp. 12,754% y Pediococcus sp. 6,536%, los porcentajes más representativos; en pupa 79 géneros (Tabla 3), Acinetobacter sp. 21,188%, Staphylococcus sp. 8,118%, Lactobacillus sp. 7,909%, Planomicrobium sp. 6,531%, Corynebacterium sp. 5,785%, Micrococcus sp. 5,670%, Kocuria sp. 5,42% y Brevundimonas sp. 5,402%, siendo los 8 primeros los de mayor porcentaje; para estado adulto (obrera) (Tabla 4), se identificó 53 géneros bacterianos, siendo los 3 primeros los de mayor porcentaje Lactobacillus sp. 91,81%, Pediococcus sp. 5,10% y Halospirulina sp. 2,4%. Además, se identificó 6 géneros de bacterias presentes en la microbiota de los estados de desarrollo (Tabla 5), siendo Lactobacillus sp., el de mayor porcentaje, resultados que concuerdan con los reportados por (^{Dürre et al., 2014}; Forsgren et al., 2017; ^{Belkaid et al., 2017}; ^{Ngalimat et al., 2019}; ^{Ribière et al., 2019}; ^{Romero et al., 2019}; ^{Rouzé et al., 2019}).

b. Microbiota intestinal pendiente de medio de cultivo

Mediante técnicas de medio de cultivo (Tabla 6), fueron identificadas seis cepas bacterianas provenientes de los estados de desarrollo de M. mimetica con su respectiva homología para huevo, Bacillus subtilis subsp. Subtilis con 100%, pupa Paenibacillus xylanilyticus con 99,62% y adulto cuatro especies con su respectiva homología, Humibacter sp. 98,99%, Acinetobacter nectaris con 98,33%, Acinetobacter sp., y Fructobacillus sp. con 100%.

Los resultados obtenidos muestran una variada microbiota en los estados de vida de M. mimetica, donde se aprecia seis géneros muy relacionados a estos, de los cuales Acetinobacter sp., es reportado que habita en el agua y suelo, siendo un importante patógeno de infecciones hospitalarias; Clostridium sp., habitante de la flora intestinal de animales y humanos reportados por degradar azúcares, alcoholes, aminoácidos, purinas, pirimidinas y polímeros como el almidón y la celulosa, (^{Dürre et al., 2014}); Pseudomonas presente en el suelo, agua dulce, filosfera y rizosfera de plantas e insectos, así mismo; Lactobacillus sp., Pediococcus sp. y Streptococcus sp., que pertenecen al grupo de bacterias del ácido láctico (BAL) de gran importancia en la salud de las abejas, (^{Díaz et al., 2017}; ^{Kwong et al., 2016} y ^{Ribière et al., 2019}), y la mayor presencia de Lactobacillus sp., como indicador de la buena salud de las abejas, (^{Ribbera et al., 2013}).

Los microrganismos que forman parte de la microbiota de las abejas sin aguijón, provienen en gran parte de las fuentes de alimento como el polen y néctar colectados para la alimentación de los miembros de la colonia, así como también de agua y materiales que usan y manejan para la construcción de sus nidos, envases para almacenar la miel y el polen. Resultados que concuerdan con los reportados por; (^{Bárbara et al., 2015}; ^{Zheng et al., 2019}., ^{Vit et al., 2018}; ^{Voulgari-Kokota et al., 2019}).

La presencia de estos géneros de bacterias en la microbiota de M. mimetica al igual que en otros animales es de importancia de la salud de los miembros de la colonia cumpliendo funciones metabólicas en la digestión, transformación de los alimentos y el mejoramiento del sistema inmune, estos resultados concuerdan con los reportados por (^{Hansen et al., 2014}; ^{Leonhardt et al., 2014}; ^{Shanks et al., 2017}., ^{Alberoni et al., 2018}; ^{Endo et al., 2018}; ^{Menegatti et al., 2018}; ^{Zheng et al., 2019}).

Los resultados de esta investigación nos permitirán realizar otros trabajos como la biología, comportamiento y formas de conservación de M. mimética y su relación con su microbiota.