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INTRODUCCIÓN
Los nematodos fitoparásitos del género Meloidogyne son endoparásitos sedentarios de gran importancia económica y constituyen uno de los principales factores limitantes en la productividad de cultivos en países tropicales (Pathak, Keshari & Haider, 2000). Meloidogyne spp., se caracteriza por ser un nematodo polífago, capaz de parasitar la mayoría especies de plantas vasculares (Horrigue-Raouani, Chitwood & Chitwood, 2008; Jones et al., 2013; Daramola et al., 2015).
Entre las especies más importantes, se encuentran M. arenaria, M. incognita, M. javanica y M. hapla (Moens, Perry & Star, 2009). Además, debido al éxito del parasitismo y alta especialización desarrollada en su huésped, así como su permanencia en el suelo y alta tasa de reproducción, son difíciles de erradicar, constituyéndose en un problema fitosanitario de importancia global (Trudgill & Blok, 2001).
Existen diferentes métodos para la identificación de nematodos, a menudo se identifican con base en características morfológicas y morfométricas, en base al hospedante que parasita, su efecto patológico en el hospedante o su origen geográfico. Sin embargo, estos criterios tienen ciertas limitaciones cuando se realizan identificaciones específicas y se hace necesario el empleo de métodos complementarios y confirmatorios más precisos como el caso de las técnicas moleculares (Carneiro & Cofcewicz, 2008; Rusinque, Inácio, Mota & Nóbrega, 2018).
A pesar de que los métodos morfológicos poseen sus ventajas en algunos casos, para conseguir una correcta identificación, se vuelve necesario y obligatorio el uso de otras técnicas como la caracterización enzimática y técnicas de PCR basada en la amplificación de genes de interés (Eisenback & Hunt, 2009; Oliveira et al., 2016).
La caracterización bioquímica de nematodos es una metodología muy sensible, que requiere únicamente de la presencia de una hembra joven para poder ser realizada (Carneiro et al., 2005; Oliveira, Oliveira & Gonçalves, 2006). Una comparación de esterasas muestra la mayor precisión para poder distinguir las especies de Meloidogyne; sin embargo, cuando los perfiles de esterasa son semejantes, los perfiles de malato deshidrogenasa son más precisos en la identificación (Horrigue-Raouani et al., 2008; Hunt & Handoo, 2009; Rusinque et al., 2018).
Los métodos moleculares basados en técnicas como la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), se caracterizan por la alta sensibilidad y especificidad, (De Weerdt et al., 2011; Akyazi, 2013; Daramola et al., 2015; Sapkota et al., 2016). Estos métodos están revolucionando la clasificación taxonómica y el estudio genético de los nematodos, constituyéndose en una herramienta importante en la identificación de nematodos fitoparásitos mediante la amplificación y secuenciamiento de regiones genéticas como ITS (Internal transcribed Spacer), ADNr 18S y 28S D2/D3, Espaciador intergénico (IGS-2); así como el uso de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphic) y SCAR (Sequence Characterizied Amplified Region) (Duarte et al., 2016; Ye et al., 2015).
La implementación del uso de estas herramientas, tiene un efecto en el tiempo que implica un diagnóstico correcto y confiable, lo que permitiría a posterior poder desarrollar técnicas de control más precisas y una disminución de las pérdidas ocasionadas por estos fitoparásitos (Adam et al. 2007; Oliveira et al. 2016; Rusinque et al. 2018).
El objetivo de esta Revisión es dar a conocer aspectos sobre los relatos existentes de Meloidogyne spp y las técnicas que se usan en la identificación de este nematodo fitoparásito.
Métodos de identificación de especies de Meloidogyne spp.
Morfología y morfometría
La identificación clásica de las especies del género Meloidogyne se basa principalmente en caracteres morfológicos y morfométricos. El procedimiento más utilizado para la identificación de especies, era mediante el estudio del patrón perineal en la región posterior del cuerpo de las hembras adultas (Kaur & Attri 2012). Esta región incluye áreas como la de la vulva-ano (el perineo) (Hunt & Handoo, 2009). Los padrones perineales de poblaciones de M. incognita y M. javanica presentaron leves variaciones morfológicas por la influencia de factores como el hospedante. Es por eso que también se utilizan características morfológicas de la región cefálica y estilete de la hembra, macho y segundo estadío juvenil; forma y tamaño de la cola del segundo estadío juvenil (Eisenback & Triantophyllu, 1991). Sin embargo, individuos del segundo estadío juvenil son suplementarios y generalmente no se utilizan en la identificación rutinaria de especies (Magunacelaya & Dagnino, 1999).
Debido a la similaridad morfológica y morfométrica existente entre especies de Meloidogyne, la forma más apropiada de realizar una caracterización es por medio de una combinación de caracteres diferenciales de hembras, machos y juveniles de segundo estadio (Carneiro & Cofcewicz, 2008). Pero en la diferenciación de Meloidogyne, los caracteres morfológicos son más utilizados que los morfométricos, ya que estos últimos pueden verse más afectados por las condiciones ambientales (Hunt & Handoo, 2009).
Para poder observar y medir las dimensiones de los nematodos fitoparásitos es necesario el uso de equipos adecuados como el microscopio óptico, así como para poder realizar fotografías o diagramas de sus estructuras. También se utiliza el microscopio electrónico de exploración, como una herramienta de trabajo para el diagnóstico, pues permite ver mucho más claramente algunos detalles morfológicos que no pueden ser visualizados correctamente usando el microscopio óptico compuesto; incluso permiten mostrar diferencias morfológicas entre poblaciones o razas de diferentes especies; entre los más importantes caracteres morfológicos revelados por el microscopio electrónico de exploración se encuentran los de la región cefálica en las hembras, machos y juveniles, así como detalles de las estructuras que ocurren en la cutícula y en la región de la cola en hembras y machos (Rodríguez, 2000; Hartman & Sasser, 1985).
Identificación por medio de isoenzimas
La técnica de electroforesis de proteínas e isoenzimas consiste básicamente en que los extractos proteicos solubles se separan en gel de poliacrilamida bajo campo eléctrico de acuerdo con su masa molecular diferente (PAGE). La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2-D-PAGE) también puede utilizarse para una mejor separación. En este caso, las proteínas se separan en la primera dimensión de acuerdo con su punto isoeléctrico y en el segundo de acuerdo con su masa molecular (Carneiro & Almeida, 2001). Los perfiles electroforéticos de isoenzimas, particularmente EST esterasas y la malato deshidrogenasa MDH son diferentes para cada especie (Silva et al., 2016). También se utilizan perfiles de superóxido dismutasa SOD y glutamato-oxaloacetato transaminasa GOT (Karssen & Moens, 2006, Blok & Powers, 2009).
La comparación de perfiles electroforéticos de esterasas muestra una gran consistencia para distinguir especies de Meloidogyne spp (Carneiro et al., 2005; Oliveira et al., 2006; Steffen et al., 2007); sin embargo, los perfiles de malato deshidrogenasa ayudan a identificar cuando los perfiles de esterasa son similares, como, por ejemplo, con M. incognita y M. hapla. Algunas especies, como M. arenaria, muestran varios perfiles diferentes, aunque esto puede indicar la existencia de especies crípticas (Hunt & Handoo, 2009).
En un trabajo desarrollado por Esbenshade y Triantaphyllou (1985), se destacó el uso de patrones de esterasa para diferenciar 16 especies de Meloidogyne, entre las que se destacaron fenotipos de M. incognita, M. arenaria, M. javanica y M. hapla. Por otro lado, en una investigacion hecha por Carneiro et al. (2001) se utilizaron cuatro enzimas distintas (esterasa, malato deshidrogenasa, superóxido dismutasa y glutamato oxaloacetato transaminasa) para realizar la caracterización de más de 100 poblaciones originarias de diferentes Estados de Brasil y países de América. Por lo tanto, fue posible determinar 34 fenómenos enzimáticos para diferentes especies de Meloidogyne, incluidos 18 fenotipos de esterasa, 6 de malato deshidrogenasa, 5 de superóxido dismutasa y 5 de glutamato oxaloacetato transaminasa.
Identificación molecular
La utilización de técnicas moleculares para diagnósticos de diferentes especies de fitopatógenos como los nematodos, ya sea por medio de análisis de ADN o análisis de proteínas se ha incrementado en los últimos años, garantizando así una mayor precisión en la identificación de las especies (Waele & Elsen, 2007). La identificación por medio del material genético es ventajosa debido a que no está influenciada por las condiciones ambientales o por el estadio de desarrollo del nematodo; es decir, la utilización de técnicas moleculares tiene un gran potencial en la identificación rutinaria de nematodos (Al-Banna et al., 2004).
Una de las primeras técnicas utilizadas en identificación molecular fue el uso de Fragmentos de Restricción Polimórficos (RFLPs), esta técnica es basada en el estudio de Polimorfismos generados mediante el uso de Enzimas de restricción como las endonucleasas que cortan el ADN en diferentes puntos, generando fragmentos que son separados posteriormente por medio de electroforesis (Becerra & Paredes, 2000), se ha utilizado esta técnica para diferenciar poblaciones de M. arenaria raza 2, cuando la identificación morfológica fue insuficiente, permitiendo diferenciar las poblaciones en muestras de hasta 30 nematodos (Carpenter et al. 1992), de la misma forma se ha utilizado de forma combinada con estudios de fenotipos de esterasas para identificación de Meloidogyne (Fargette et al. 1996).
En la actualidad, los métodos moleculares basados en PCR para la identificación de las especies de Meloidogyne, incluyen el uso de regiones objetivas tales como: mtDNA (ADN mitocondrial) (Tigano et al., 2005; Powers et al., 2005), rDNA (ADN ribosómico) (Zijlstra et al. 1997; Saeki et al., 2002; Monteiro, 2016), región IGS (espaciador intergénico) (Wishart et al. 2002) y secuencias de los genes 18S, 5.8 y 28S del rDNA. Los métodos incluyen el uso de RFLP (Xu, et al., 2004), RAPD (Amplificación aleatoria de ADN polimórfico) (Tigano et al., 2010), sondas de microsatélites y ADN satélite, PCR multiplex (Saeki et al., 2002), iniciadores específicos SCAR (Zijlstra et al., 2000; Tigano et al., 2010; Jorge, 2016; Mattos, 2017) y PCR en tiempo real (Toyota et al. 2008; Agudelo et al., 2011; De Weerdt et al., 2011; Sapkota et al., 2016).
Técnicas como PCR multiplex son muy útiles en la identificación de varias especies de forma conjunta, debido a que este tipo de procedimientos permiten amplificar varios segmentos de ADN, en una sola reacción por medio del uso de dos o más sets de iniciadores (Bolívar et al. 2014), esta técnica ha sido ampliamente empleada para la identificación y detección de M. incognita, M. enterolobii, M. javanica y M. arenaria (Hu et al. 2011; Devran et al. 2018; Wolf et al. 2013), usando ADN extraído de agallas provocadas por el nematodo en China y Turquía, así como en países del sudeste europeo, con la finalidad de desarrollar un método rápido de identificación. Este tipo de técnica ha sido utilizada en la identificación de Meloidogyne spp., y Pratylenchus spp., mediante el uso de iniciadores específicos, a partir de muestras de suelo donde existen la presencia de otros nematodos (Saeki et al. 2003).
La PCR convencional es un método de detección cualitativo, mientras que la PCR en Tiempo Real (Real Time PCR), se caracteriza en ser un método de detección pero que en forma simultánea cuantifica el producto amplificado por medio de la emisión de fluorescencia que es interpretada por un lector acoplado al termociclador (Cunha et al., 2018). Empleando esta técnica, De Weerdt et al. (2010) desarrollaron un método para la identificación de M. minor a partir de ADN de un J2 en presencia de 10 poblaciones de seis especies de nematodos de las agallas. Así mismo Sapkota et al. (2016) identificaron M. hapla de raíces y suelo provenientes de un cultivo de zanahoria de campos infestados en Dinamarca. Otras especies tales como: M. incognita, M. enterolobii, M. javanica, M. graminícola han sido identificadas por medio de PCR en tiempo Real, ya sea solas o en muestras donde existe la presencia de otros nematodos fitopatógenos como Globodera rostochiensis, Pratylenchus zeae y Xiphinema elongatum (Kiewnick, Frey & Braun-Kiewnick, 2015;(Zhao et al., 2010; Toyota., 2008; Nguyễn et al., 2014; Berry et al., 2008).
Los métodos más recientes basados en PCR convencional usaron primers que son capaces de distinguir especies sin una etapa de digestión posterior (Kumar & Gurusubramanian, 2011), describieron la técnica RAPD (Amplificación aleatoria de ADN polimórfico) como una técnica utilizada para identificar la variación genética entre poblaciones de organismos por medio de la detección de polimorfismos; los marcadores moleculares RAPD se obtienen después de la amplificación por PCR de segmentos aleatorios del ADN, utilizando secuencias arbitrarias o no específicas de oligonucleótidos iniciadores. (Williamson et al., 1997. De la misma forma, Abd et al. (2019) sintetizaron y evaluaron primers de PCR derivados de las secuencias de RAPD en poblaciones de nematodos.
La técnica RAPD, fue utilizada años más tarde por Zijlstra et al. (2000), que usaron los marcadores específicos OPA-l2420, OPB-061200, OPA-OI700, mediante el secuenciamiento de esas regiones génicas, fueron identificados individuos de M. chitwoodi, M. fallax, M. hapla, M. incognita, M. javanica y M. arenaria, a partir de muestras colectadas principalmente en regiones tropicales y subtropicales. Por otro lado, en muestras colectadas en plantaciones bajo el sistema cultivo protegido, fueron analizadas muestras de ADN extraídas de masas de huevos, J2 y hembras, para la identificación precisa de M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. mayaguensis, M. hapla, M. chitwoodi y M. fallax en combinación con marcadores de tipo Scar (Adam et al., 2007).
Los marcadores SCARs, son una de las herramientas moleculares más efectivas y precisas usadas para la identificación de microorganismos (Lee et al., 2013). Un SCAR es un fragmento de ADN genómico en un solo locus, genéticamente definido que es identificado por amplificación por PCR usando un par de iniciadores específicos, generalmente de 15 a 30 pares de bases (Paran & Michelmore, 1993). Los marcadores de SCAR presentan ventajas sobre los marcadores RAPD porque su amplificación por PCR es menos sensible a la condición de reacción (Paran & Michelmore, 1993; Bautista et al., 2002). Además, la amplificación por PCR de los SCARs es reproducible y puede ser fácilmente detectada. Por lo tanto, el análisis usando marcadores SCAR es simple, rápido y fácil de ejecutar (Yuakianti & Shiraishi, 2010).
Otra técnica empleada es AFLP, Fragmentos Polimórficos Amplificados al Azar, en esta técnica se basa en la amplificación por PCR de fragmentos que originados por enzimas de restricción, de esta forma se combinan los fundamentos de las técnicas RFLP y PCR, al igual que RAPD es de herencia dominante y ha sido utilizada ampliamente para caracterizar la diversidad genética de fitopatógenos (Becerra & Paredes, 2000; Mayer et al., 2010; Dos Santos et al. 2013; Casanovas et al. 2013; Rocha et al. 2015). como para analizar la diversidad genética de poblaciones de M. chitwoodi y M. fallax, donde se demostró la presencia de diversos grupos poblacionales de estos nematodos(Fargette et al., 2005), así mismo se ha utilizado esta técnica en combinación con marcadores RAPD, demostrando que la diversidad de poblaciones de M. incognita provenientes de cultivos de algodón en el estado de Bahía no se encuentra relacionada con la virulencia en relación a accesiones resistentes, lo que podría deberse a la presencia de 1 o 2 genes de resistencia en estos cultivares (Lopes et al., 2019)
Existen otras técnicas para la identificación molecular de Meloidogyne como la técnica LAMP (Amplificación isotérmica de ADN mediada por asas), que puede amplificar grandes cantidades de ADN con gran precisión, en un tiempo corto y además como es isotérmica puede realizarse a una sola temperatura estable, lo que resulta en que no necesita del uso del termociclador y los productos que derivan de la reacción pueden ser observados a simple vista en tubos de reacción, empleando colorantes de ligación al ADN (Mori & Notomi, 2009). Esta técnica ha sido empleada para amplificar segmentos genéticos como el espacio intergénico IGS2-18S, 5S, ITS del rDNA para la correcta y precisa identificación de M. chitwoodi, M. enterolobii y M. hapla (Niu et al., 2012; Peng et al., 2017).
Tabla 1. Primers utilizados para la identificación de Meloidogyne spp. Adaptado de (Mao et al., 2019)
| Especie | Primers | Secuencia de los primers 5" A 3" | (pb) | Referencia |
| M. incognita | Finc/ Rinc | GGGATGTGTAAATGCTCCTG CCCGCTACACCCTCAACTTC | 399 | Randig et al., 2002 |
| M. arenaria | Fare/ Rare | TCGGCGATAGAGGTAAATGAC TCGGCGATAGACACTACAACT | 420 | Zijlstra et al., 2000 |
| M. javanica | Fjav/ Rjav | ACGCTAGAATTCGACCCTGG GGTACCAGAAGCAGCCATGC | 517 | Meng et al., 2004 |
| M. exigua | Fexi/ Rexi | CATCCGTGCTGTAGCTGCGAG CTCCGTGGGAAGAAAGACTG | 562 | Randig et al., 2002 |
| M. hapla | Fhap/ Rhap | TGACGGCGGTGAGTGCGA TGACGGCGGTACCTCATAG | 610 | Zijlstra, 2000 |
CONCLUSIONES
La identificación de las especies del nematodo fitoparásito Meloidogyne ha sido realizada principalmente mediante el uso de características morfométricas, sin embargo pueden existir ciertos inconvenientes en la identificación empleando únicamente este tipo de metodología, por tal motivo el empleo de técnicas más modernas como el uso de marcadores moleculares basadas en estudio de ADN son empleadas de forma principal y rutinaria en la identificación de especies, debido a la alta precisión y confiabilidad en los resultados generados puede incluir de forma concisa, una posible investigación futura que se pueda realizar.
