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INTRODUCCIÓN
El EB es una alternativa de conservación mejorada (Safari et al., 2022), se caracterizan por prolongar la vida útil de la materia prima convirtiéndola en una alternativa para la alimentación animal (Fernández et al., 2017; Mohanty et al., 2020; Ziyaei & Hosseini, 2021). El ensilado biológico (EB) utiliza mayormente bacterias ácido lácticas (BAL) nativas, en un proceso de fermentación controlada y eficiente (Lezcano et al., 2015; Nag et al., 2022), utiliza subproductos del procesamiento de aves (Eissa et al., 2022), peces e hidrobiológicos (vísceras, cabezas, colas) es considerado un proceso de hidrólisis controlada (Okoye et al., 2023), que mejora el valor nutritivo de la materia prima utilizada (Palkar, 2018; Ziyaei & Hosseini, 2021), aportan nutrientes esenciales y funcionales (Sun et al., 2023). El EB agregado a las dietas mejora la salud intestinal con propiedades funcionales, BAL productoras de feruloil esterasa, antimicrobiano, ácido láctico con alto potencial antioxidante (Guo et al., 2023), buscando BAL de alto rendimiento que mejore la nutrición animal (Okoye et al., 2023; Sajib et al., 2022), de pollos y cerdos (Castillo et al., 2019; Fernández, 2021; P. P. García et al., 2020; Shabani et al., 2019), además se pude utilizar y combinar como materia prima vegetal (Costa et al., 2024), oleaginosos, algas, pescado y otras materias orgánicas (Castillo-Mercado et al., 2020; Rathod & Kairam, 2018).El EB es una buena alternativa de bioconservación (Nag et al., 2022).
Las BAL nativas aisladas del intestino de los animales, tiene efectos bactericida (Guo et al., 2023) y fermentadora (Okoye et al., 2023), son ácido tolerante (la mayoría crece a pH entre 4 y 4,5), toleran sales y son consideradas benéficas (Rabaoui et al., 2022). Los géneros reportados son mayormente Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus y Streptococcus; que degradan glucosa (vía de glucólisis) mediante fermentación (Guo et al., 2023), pueden cultivarse, sobrevivir a condiciones semejantes al tracto digestivo y producen fermentos e hidrolizados estables para ser utilizados en la alimentación animal (Castillo-Mercado et al., 2020; Castillo et al., 2019; Sulfahri et al., 2020) incluso algunos microrganismos han sido utilizados comercialmente para producir ensilado inocuos destinados a la alimentación animal (FEEDAP et al., 2023).
En los desembarcaderos de pescado, se acostum-bra a realizar labores de fileteo artesanalmente lo que genera residuos orgánicos que no tienen una disposición final inadecuada. En Puerto Pizarro, localidad ubicada en la ciudad de Tumbes, reporta de 45 000 kg de (Diplectrum conceptione), y otras 40 000 kg de otras especies que incluye el pescado (Chelidonichthys obscurus) al año (Salazar et al., 2015), que al fileteo eliminan el 40% a 50% de residuos entre vísceras, esqueleto, cabeza y piel (Rojas-Runjaic et al., 2011), consideradas fuente de nutrientes que no se aprovechan y son perecibles (Lezcano et al., 2015). Una forma de manejo y de conservación como fuente de alimento animal es convertirlos a EB.
Se conoce poco sobre las variantes en el proceso de producción del EB según la temperatura de incubación, tiempo y cepas nativas utilizadas (Calderón-Quispe, 2017; Espe & Lied 1999), como afectada en el proceso la cepa y la temperatura para obtener el EB con la cantidad adecuada de proteína y este pueda ser utilizado en la alimen-tación animal, el producto final de los hidrolizados para alimentación animal generalmente son modificados por acciones enzimáticas, microrga-nismos y temperatura (Dragunova et al. 2018; Hien et al. 2022) para tener acceso a la proteína animal, (Sharma and Verma 2019). Por otro lado, la actividad del procesamiento de productos hidrobiológicos y residuos de actividades de fileteo de pescado, generan gran volumen de residuos que pueden ser utilizados mediante técnica para obtener el EB como alternativas viables para la alimentación animal (Tsoy et al., 2020). lo cual permitiría bajar los altos costos del alimento utilizado en la producción pecuaria (Calderón-Quispe, 2017) y reemplazara a tecnologías gené-ticas controversiales e insumos modificados según la Unión Europea (Gödecke et al., 2018).
Buscando un proceso de fermentación del EB más eficiente, el objetivo de este estudio fue determinar el efecto del uso de diferentes BAL extraídas del tracto digestivo de gallina o cerdo como fermenta-dores, tiempo de incubación y dos tipos de residuos de pescado en la elaboración del EB.
METODOLOGÍA
Se colectó 12 kg de residuos del fileteo de C. obscurus y D. conceptione, en estado fresco, en Puerto Pizarro - Tumbes (coordenadas GMS 3°29´59” y 80°23¨25” W 0,53 m.s.n.m.) y trasladadas al laboratorio de Cárnicos (Escuela de Agroindustrias)
Universidad Nacional de Tumbes (coordenadas GMS 3°30´10” y 80°23¨38” W), respetando la cadena de frío.
En la misma localidad fueron aisladas las BAL del tracto digestivo de gallina de traspatio, sacrificada humanitariamente (previo aturdimiento) y de la parte final del recto de cerdo de traspatio (50 kg de peso vivo), mediante hisopado. Las muestras se colocaron en suero fisiológico y trasladadas en tubos cónicos estériles de 50 ml, hasta el la Facultad de Ciencias de la Salud en el Laboratorio de Biología Molecular (LBM) de la Universidad Nacional de Tumbes (Mogollón et al., 2021).
Método de preparación
Aislamiento y selección de BAL nativas
Las muestras colectadas fueron sometidas a diluciones seriadas hasta la 10-5 y se sembró en medio especifico Agar Man, Rogosa y Sharpe (MRS) con azul de anilina al 0,013%, aislando las colonias teñidas de azul intenso para ser purificadas en el mismo medio MRS sin azul de anilina y conservadas a -4 °C (Mogollón et al., 2021). Las cepas BAL seleccionadas se le realizaron pruebas bioquímicas como oxidasa, catalasa y generación de gas, para ser seleccionar como fermentadoras metabólicas (MacFaddin, 2003; Salehizadeh et al., 2020; Wang et al., 2020).
Análisis Molecular de las BAL
Se realizó tomado como referencia el método estándar CTAB-DTAB utilizado por (Mogollón et al., 2021), con los primers 8F (5´ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3´) y 1510R (5´ GGC TAC CTT GTT ACG A 3´) para, el producto amplificado fue verificado por electroforesis en gel de agarosa al 1% (120 V durante 20 minutos). Para la secuenciación se preparó 10 μl de los productos de PCR y 5 μl de cada cebador universal para el gen 16S ARNr, destinados a la empresa Macrogen de Korea (Mogollón et al., 2021).
Activación de BAL y preparación de inóculo fermentador del EB
Las cepas BAL obtenidas de gallina (BAL 1) y cerdo (BAL 2), identificadas y caracterizadas fueron utilizadas independientemente para hacer dos inóculos, inicialmente se activaron sembrándolas en agar MRS, incubándolas por 48 horas a 32 °C (García et al., 2020), dos a tres colonias fueron sembradas en tubos con caldo MRS (10 ml), incubándola a 35°C por 48 horas, se determinó la concentración de células BAL en el caldo MRS, por espectrometría y densidad óptica (DO) con longitud de onda de 630 nm (Activación de BAL). Para la preparación del inoculo (yogurt), se calentó medio litro de leche entera a 85 °C por 10 minutos, dejándola enfriar hasta 40 °C, el medio litro se distribuyó en dos recipientes de 250 ml, a cada uno se le agrego independientemente un ml de BAL activada en caldo MRS y en concentración de 1 según DO, se incubó a temperatura de 40 °C por 18 horas, luego 50 ml de este producto se mezcló con un litro de leche pasteurizada y se volvió a incubar a 40 °C por 5 horas y el nuevo producto se conservó en refrigeración hasta su uso (yogurt, inoculo lácteo fermentador del EB) métodos según (Mogollón et al., 2021; Reyes-Jurado et al., 2014).
Preparación del ensilado
Los restos del fileteo de C. obscurus o D. conceptione se cocinaron por 10 minutos, luego se trituraron en un molino eléctrico para carne marca HENKEL, TC22, frecuencia de 60HZ, 0,75 KW, se utilizó 70% de esta materia prima, melaza 25% y 5% inóculo bacteriano fermentador (Castillo et al., 2019), esta mezcla se colocó en fundas plásticas de 200 g con cierre hermético dejando el 25% de espacio libre en su interior (5 fundas por tratamiento), se tuvo en cuenta para tratamiento dos tipos de residuo de pescado, tres diferentes temperaturas de incubación y dos cepa BAL.
Evaluación de parámetros del EB
Se realizó según prueba incubación a temperatura ambiente (27 °C a 32 °C), utilizando dos BAL (BAL 1 gallina, BAL 2 cerdo) y dos residuos de pescado (C. obscurus o D. conceptione) y prueba a diferentes temperaturas de incubación, utilizando BAL de cerdo, dos residuos de pescado (C. obscurus o D. conceptione) y tres temperaturas de incubación (TA, 30 °C o 40 °C).
Se realizaron los análisis fisicoquímicos y órgano-lépticos del EB los días 3, 5, 10, 15 y 30, valor nutricional los días 3 y 30, control microbiológico en los días 15 y 30, buscando su estabilidad para ser considerado alimento proteico para cerdos (menor pH obtenido, mayor porcentaje de acidez (%A) y mayor de 20% de proteína) según (Ghosh et al., 2022). Los análisis microbiológicos y fisicoquímicos se realizaron en el (LBM) de la Universidad Nacional de Tumbes y bromatológico en laboratorio LENA de la Universidad Nacional Agraria la Molina.
Análisis fisicoquímico del EB
Se evaluó el pH, temperatura y acidez por el método de titulación con NaOH al 0,1 N (Martínez Prada, 2003).
Medición del pH
Método potenciométrico, se utilizó el equipo portátil HANNA HI 8915, por medida directa, utilizando el electrodo en cada muestra homogeneizada hasta su estabilización y lectura por 10 segundos, calibrado para cada muestra utilizando soluciones buffer de pH 4 y 7 (Castillo et al., 2019).
Medición del porcentaje de acidez titulable.
Se midió como acidez referenciada del ácido láctico, mediante la metodología de la AOAC (1998), se utilizó el hidróxido de sodio a 0,1 N para la titulación, el cambio de pH del indicador final donde fenolftaleína da un viraje de pH 8,1 +/- 0,2, como muestra se tomaron 10 gr en 50 ml de agua destilada (Castillo et al., 2019).
Análisis bromatológico del ensilado
Se utilizó 100 gr de muestra seca del EB (Balfagón et al., 2014), secado a 70 °C por 48 horas en estufa con aire circulante marca memmertem +/- 250 °C (Southgate & Greenfield, 1992), luego fue molida, tamizada y envasada para su evaluación nutricional, mediante análisis proximal de alimentos, UNALM del 2009 determinación de la humedad, método por secado en estufa, proteína cruda, método Kjeldhal, Fibra cruda por Gravimétrico con ácido-álcali (H.), análisis de lípidos, método de Soxhlet (James, 1999), determinación de minerales (calcinación en mufla), Fibra cruda por Gravimétrico con ácido-álcali (H.), extracto libre de nitrógeno (ELN), por diferencia, UNALM, 2009 (Sintagma et al., 2013).
Análisis microbiológico
Se colectó 150 g de muestra de EB de cada tratamiento (DIGESA, 2001). En una cámara de flujo laminar (Labotecgroup.com, modelo BBS - DDC) se realizó el análisis microbiológico, cada 25 g de muestra y 225 ml de agua peptonada como diluyente, se realizó diluciones seriadas hasta 10-5 en tubos cónicos, se agitó por 20 s en un vortex. De cada muestra se retiró 100 μl para ser sembradas por extensión en superficie en placa Petri, por duplicado (Fernández-Herrero et al., 2013). Se utilizó incubado IN30 marca memmert. Se realizó el recuento de microorganismos según (Martínez, 2003), recuento total de mesófilos aerobios en medio Plate Count, recuento de BAL en medio MRS, recuento de salmonella en medio específico para salmonella, SS Agar, recuento de levaduras y mohos en el Agar Sabouraud, incubadas por 48 horas a temperatura ambiente en placa invertida (Fernández-Herrero et al., 2013).
Análisis organoléptico
Se consideró el criterio del personal de laboratorio (05 personas) para evaluar evaluaron las características como son olor, color y consistencia del EB, en forma directa, lo cual se refiere al estímulo percibido por los órganos de los sentidos para productos fermentados (Zapata et al., 2015; Castillo et al., 2019).
Diseño y análisis estadístico
Diseño experimental, (a). Prueba incubación a temperatura ambiente, utilizando dos BAL y dos residuos de pescado, se utilizó 4 tratamientos, 3 repeticiones; (b). Prueba a diferentes temperatu-ras de incubación, utilizando BAL de cerdo, dos residuos de pescado y tres temperaturas de incubación, en 6 tratamientos y 3 repeticiones.
Los datos del pH, acidez titulable (%A), según días de incubación y temperatura del EB, de las variables en tratamiento fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) al 95% del nivel de confianza, la determinación de medias compa-rativas entre tratamientos se realizó con la prueba de Tukey y análisis de regresión según software Excel.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron 4 cepas viables, aisladas, purificadas, caracterizadas e identificadas de BAL provenientes del tracto digestivo del cerdo y/o gallina, las características microscópicas y bioquímicas para selección de colonias fueron: teñidas de azul intenso en medio especifico (Arteaga-Chávez et al., 2017), purificación en agar MRS, según método (Eyeralde, 2018; Hernández-García et al., 2019), observadas como bacillos Gram positivas (Chiang et al., 2015; Fadare et al., 2023), con crecimiento variable (Ng et al., 2015). Las BAL fueron oxidasa negativa, presentaron reacción catalasa negativa y no producían gas, características de las BAL según (Cossio et al., 2018; Fadare et al., 2023; Wang et al., 2020), resistente a concentraciones de pH 3,5 semejante a pH 3 a 3,4 y un óptimo pH 3,5 reportado (Henry et al., 2015; Vera-Mejía et al., 2018), también resistieron concentraciones al 9% NaCl y 5% sales biliares, características de BAL probióticas (Hernández-García et al., 2019; Mugwanda et al., 2023), condición encontrada en la cepas BAL estudiadas que coinciden con lo reportado por (Kern et al., 2017; Mogollon et al., 2021; Wang et al., 2020).
Evaluación del análisis molecular
Secuenciación de ADN
Las cepas BAL, L. brevis y E. avium, encontradas e identificadas molecularmente (Tabla 1), están pre-sentes como microorganismos nativos del tracto digestivo del gallina y cerdo (Alzahrani et al., 2022; Liu et al., 2015), pueden ser aisladas de las excretas tanto de cerdos como en aves. E. avium se encuentra en las excretas de los pollos (Wang et al., 2020), representa el 3,3% de todos los Enterococcus spp. aislados de excretas de pollo de parvadas pequeñas (Alzahrani et al., 2022), también se encuentra en otros ambientes y comúnmente en las heces del pollo (Park et al., 2017). También se identificaron en la microflora del tracto gastrointestinal de pollos vivo, mediante el MALDI TOF MS y pruebas bioquímica API 50CHL en aves (Betancur et al., 2020). Se considera como potencial probiotico y prebiotico atribuida a la producción de ácido láctico en tres cepas de E. Avium aisladas del rumen y del queso Motal de Irán (Hu et al., 2022; Kouhi et al., 2022). E. Avium aislada del tracto enterogastrointestinal de mamíferos produce bacteriocinas (Lengliz et al., 2021), también se reportan el aislamiento en excretas de humanos del E. avium ATCC14025 y uso como posibles probióticos, con características fisiológico-bioquímicas aceptables y productoras de hexahidrocurcumina (Niwa et al., 2021) al igual de tres cepas E. avium aislados de excretas de niños, (Chu et al., 2020; Wang et al., 2020), se indica que el L. brevis puede ser aislado de la mucosa intestinal de lechones (Feng et al., 2017), como la cepa L. brevis ATCC 8287 (Gebert et al., 2011; Lähteinen et al., 2014). También se aisló del tracto digestivo del pollo (Betancur et al., 2020)
Tabla 1 Identificación molecular de cepas BAL extraídas de la parte final del tracto digestivo del cerdo y de gallina
| Cepas | Tamaño de secuencia (pb) | Especie identificada semejantes a | Identidad % | N° de accesión |
|---|---|---|---|---|
| BAL 01 (g) | 2615 | Enterococcus avium strain FDAARGOS 184 chromosom | 99 | CP024590.1 |
| BAL 02 (c) | 2717 | Lactobacillus brevis strain UCCLB521 | 99 | CP031208.1 |
| BAL 03 (c) | 2734 | Lactobacillus brevis strain UCCLB556 | 99 | CP031174.1 |
| BAL 04 (g) | 1439 | Lactobacillus brevis strain 1976 16S | 99 | MT640328.1 |
Gallina (g), cerdo (c).
El L. brevis MF179529 fue utilizado como probiótico en pollos, el L. brevis ATCC 8287, es considerado que tiene propiedades funcionales y probiótico (Chu et al., 2020, Gebert et al., 2011, Lähteinen et al., 2014, Ostadzadeh et al., 2022). Se observó que pacientes con periodontitis y coronavirus 19 se beneficiaron al utilizar el L. brevis como probiótico en los tratamientos (Baindara et al., 2021, Pudgar et al., 2020), fue utilizado como probiotico descontaminante (Mushtaq et al., 2023) y con actividad antimi-crobiana (Rabaoui et al., 2022). En la elaboración de yogures se utilizó el L. brevis ATCC 14869, L. brevis KU200019, L. brevis ATCC 14869 y L. brevis KU200019, los cuales almacenados a 4 °C durante 21 días presentaron un alto nivel de antioxidantes (Kariyawasam et al., 2021) y con capacidad fermentativa (Feng et al., 2017). El L. brevis ATCC 8287 también es considerado un potencial probiótico (Gebert et al., 2011; Lähteinen et al., 2014, Pérez et al., 2022) y es utilizado en aves (Betancur et al., 2020), el L. brevis MF179529 (LB) fue utilizado como probiótico para pollos de carne (Abbas et al., 2021; Noohi et al., 2020; Yang et al., 2022), con capacidad fermentativa (Song et al., 2022) y posbiotica (Liu et al., 2015; Song et al., 2022; Turner, 2018) y ser alternativas tentativas para su uso en la preparación del EB como las sepas comerciales utilizadas para este fin P. acidilactici, P. pentosaceus, L. plantarum, L. buchneri, A. acidipropionici, L. buchneri y L. hilgardii, para utilizarlos en ensilado de forrajes destinado a la alimentación animal (FEEDAP et al., 2023).
Evaluación del EB a temperatura ambiente.
En el Tabla 2 se midió el tiempo necesario para obtener la viabilidad del EB en el proceso de fermentación, según los valores de pH y % A, incubado a temperatura ambiente (entre 27 °C a 32 °C). Los EB inoculados con BAL se mantienen con un pH estable durante la etapa denominada de estabilidad, lo que genera condiciones ácidas que limitan la actividad y la población de microbios, y especies potencialmente peligrosas (Okoye et al., 2023), la estabilidad se dio a partir del día 5 de incubación, pH adecuado menores a 4,6, se mantuvo sin diferencia estadística hasta el día 30, valores considerado adecuado para los fermentos lácteo y otros alimentos fermentados para consumo (Ghosh et al., 2022; Ozyurt et al., 2020; Speranza et al., 2020), el menor pH se obtuvo en el día 10 considerado como valor de estabilidad (pH 4,26 y 4,24) para ambas BAL, estos valores son semejantes a los encontrados en ensilados químicos (EQ), aunque durante su fermentación el pH se comporta en forma inversa, aumenta de pH 2 hasta 4,2 en 30 días (Raeesi et al., 2021), el pH del EB por lo general empieza de 6 a 5 y bajan hasta estabilizarse con valores menores a 4,5 a las 72 horas, los cuales son semejantes a los obtenidos (Ghosh et al., 2022) menores al pH 4,9 a los 8 días obtenidas por (Libonatti et al., 2019) y 4,5 a los 7 días (Martins et al., 2016; Shabani et al., 2021). Con respecto a la acidez (% A) hay una ligera diferencia al comparar BAL uno y dos, la primera presento menos variaciones de acidez desde de inicio a final del proceso de fermentación, obteniendo su mayor valor al día 10 de incubación, la BAL dos presentó variaciones estadísticas durante la incubación y el mayor valor lo obtuvo a los 15 días de incubación (2,29 %A y 2,61 %A), considerado adecuados para el EB, semejantes a los obtenidos a 72 horas por (Ghosh et al., 2022), para ambos parámetros son semejantes a los obtenidos entre los días 3 a 21 del proceso de incubación de diferentes ensilados por (Ghosh et al., 2022; Libonatti et al., 2019; Lutfullah et al., 2014; Martins et al., 2016; Ozyurt et al., 2020; Raeesi et al., 2021; Shabani et al., 2021), las cepas BAL de esta familia son reportados como adecuadas para producir ensilado y reportadas con capacidad probiotica, posbiotica y fermentativo según (Baindara et al., 2021, Feng et al., 2017, Gebert et al., 2011, Kariyawasam et al., 2021, Lähteinen et al., 2014, Noohi et al., 2020, Pudgar et al., 2020), pertenece al grupo de cepas destinadas en la producción de otros ensilados, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Streptococcus spp. Y Enterococcus gallinarum (Ozyurt et al., 2020), se puede considerar ligeramente más estable en el proceso de incubación a la BAL 2.
Al comparar el comportamiento del pH y % A, teniendo en cuenta la materia prima utilizada (C. obscurus o D. conceptione) no presentaron diferencias estadísticas durante el proceso de fermentación, considerando un valor promedio de pH 4,54 a 4,55 y 4,55 a 4,75 para cada residuo respectivamente, valores adecuados como EB (Eissa et al., 2022; Ghosh et al., 2022; Martins et al., 2016; Safari et al., 2022; Zapata et al., 2015).
Tabla 2 Evaluación del EB en el tiempo incubado a temperatura ambiente (TA), fermentados con dos BAL y dos especies de residuos de pescado
| BAL 1 | BAL 2 | Promedio BAL y pescado | ||||
| C obscurus | D conceptione | C obscurus | D conceptione | |||
| Días | pH | % A | pH | % A | pH | % A |
| 0 | 5,52±0,36 a | 0,86±0,12 a | 5,74±0,17 a | 0,78±0,20 c | 5,63±0,26 a | 0,81±0,14 c |
| 3 | 4,63±0,13 b | 1,48±0,39 a | 4,80±0,58 ab | 1,30±0,14 c | 4,71±0,36 b | 1,39±0,26 bc |
| 5 | 4,37±0,09 b | 1,92±0,38 a | 4,41±0,09 b | 1,94±0,13 b | 4,39±0,08 b | 1,93±0,23 ab |
| 10 | 4,26±0,14 b | 2,29±0,38 a | 4,24±0,04 b | 2,34±0,09 ab | 4,25±0,09 b | 2,32±0,22 a |
| 15 | 4,31±0,18 b | 2,22±0,40 a | 4,36±0,22 b | 2,61±0,01 a | 4,33±0,17 b | 2,41±0,32 a |
| 30 | 4,22±0,04 b | 2,22±0,51 a | 4,38±0,18 b | 2,37±0,15 ab | 4,30±0,14 b | 2,28±0,33 a |
| C obscurus | D conceptione | |||||
| pH | % A | pH | % A | |||
| BAL 1 | 4,54±0,36 a | 1,57±0,48 a | 4,55±0,54 a | 1,87±0,73 a | ||
| BAL 2 | 4,55±0,63 a | 2,09±064 a | 4,76±0,64 a | 1,91±0,71 a | ||
(BAL 1 de gallina y BAL 2 de cerdo).
En cuanto al % A, el promedio obtenido durante el proceso fue de 1,57% a 2,09% y de 1,87 a 1,91% sin diferencia para cada residuo (Ghosh et al., 2022), lo que puede indicar que se pueden procesar como materia prima para el EB, múltiples compuestos orgánicas de origen marino como son vísceras de pescado, moluscos, crustáceos y otros (Barriga-Sánchez et al., 2019, Castillo et al., 2019, Fabiszewska et al., 2019, Safari et al., 2022, Terrones & Reyes, 2018).
En análisis de regresión, del proceso de incubación, muestra que el pH y % A, se encuentra influenciada por los días de incubación y no está influenciada según el tipo de BAL, materia prima, ni por la interacción entre ellas. (Ghosh et al., 2022; Ozyurt et al., 2020; Speranza et al., 2020), los residuos utilizados como materia prima no modifican el proceso de fermentación según (Calderón-Quispe, 2017), pero si los productos finales, el pH no cambia durante 48 días de incubación de los EQ por la cantidad y estabilidad de los ácidos químicos utilizados es más estable (Ghosh et al., 2022; Libonatti et al., 2019; Lutfullah et al., 2014; Martins et al., 2016; Ozyurt et al., 2020; Raeesi et al., 2021; Shabani et al., 2021).
Evaluación del EB a diferentes temperaturas de incubación
En esta evaluación se utilizaron la BAL 1 (cerdo), como materia prima se utilizó residuos de del fileteo de C. obscurus o D. conceptione, sometidos a tres temperaturas de incubación (TA o 30 °C o 40 °C), Tabla 3, se observa la evaluación del pH y el % A, donde el valor de estabilidad se obtuvo en el día 10 con pH 4,29, pH 4,15 y pH 4,22 según la temperatura de incubación respectivamente (TA o 30°C o 40°), donde el pH de estabilidad fue estadísticamente diferente a los obtenido en los días (3, 15 y 30), y semejante para en el día 5 a TA y 30 °C, el proceso a TA presentó menos variaciones del pH que a 30°C y 40°C, todos los pH obtenidos están dentro de los valores reportados en la estabilidad y viabilidad de diferentes ensilados (pH menores a 4,6) según (Eissa et al., 2022; Ghosh et al., 2022; Martins et al., 2016; Safari et al., 2022; Zapata et al., 2015). Durante el proceso de fermentación el EB fue más estable a partir de día 5, incubados a 30 °C y TA; también a 40 °C presento aumento del pH posterior a día de estabilidad sugiriendo un inicio de degeneración anticipada, frente al día 15 para TA y 30 °C, los valores de estabilidad y viabilidad obtenidos con estas temperaturas de incubación son semejantes a las del ensilado reportados por (Ghosh et al., 2022), pero menores a los reportados en el ensilaje de pescado de (Guimarães et al., 2021). Teniendo en cuenta la materia prima utilizada, se presentaron diferencia en el pH obtenido como valor de estabilidad en la fermentación, pH 4,17 obtenida a los 10 días usando el C. obscurus y pH 4,17 para D. conceptione, con respecto al comportamiento del pH y % A, durante el proceso de fermentación el C. obscurus fue más estable que el D. conceptione, además el % A para estabilidad se presentó a los 10 y 15 días de fermentación respectivamente (1,66% y 2,35%), todos valores de estabilidad obtenidos son adecuados para un ensilado (Eissa et al., 2022; Ghosh et al., 2022; Martins et al., 2016; Safari et al., 2022; Zapata et al., 2015). Los valores de estabilidad del pH y % A obtenido durante el proceso de fermentación del C. obscurus y D. conceptione, confirmando la viabilidad del uso de residuos acuícolas para preparación de ensilado (Barriga-Sánchez et al., 2019, Castillo et al., 2019, Fabiszewska et al., 2019, Safari et al., 2022, Terrones & Reyes, 2018).
Al evaluar el pH y A % según la temperatura alcanzada por el EB durante la incubación podemos observar que la viabilidad se obtuvo cuando esta temperatura fue de 29 °C y 30 °C incubados a TA; 32 °C cunado se incubó a 30 °C y entre 40,7 °C a 41 °C incubado a 40 °C, demostrando que hay variabilidad en la estabilidad según la Temperatura de incubación (acortado o alargando el tiempo del proceso), el pH promedio menor fue de 4,37, observado incubando a 30 °C y el % A mayor fue de 1,92 incubado TA, valores relacionadas a la requerida por la mayoría de BAL para la fermentación (Ozyurt et al., 2020) menores a los pH obtenidos por (Calderón-Quispe, 2017) y % A (Barriga-Sánchez et al., 2019). Al comparar la temperatura del EB en la incubación, observamos que el pH fue menor a 29 °C a TA, a 32 °C a temperatura de incubación de 30 °C y a 42 °C incubadas a 40 °C, teniendo menos variación en el proceso de fermentación incubado a TA y a 40 °C y mucha variación de la temperatura del EB durante el proceso de fermentación al ser incubado a 30.
Analizando el proceso según el residuo utilizado tenemos, en la Tabla 4, al comparar la convergencia de las variable temperatura y residuo evaluando el pH optimo y A % según la temperatura alcanzada por el ensilado fue más estable a 32 °C (4,21 pH y 2,07 % A) que difieren estadísticamente con la temperatura alcanzada entere los 40 a 42 °C como las menos estables (Fernández, 2021; Terrones & Reyes, 2018).
Tabla 3 Evaluación de la viabilidad del EB en el tiempo, fermentados con dos especies de pescado a diferentes temperaturas de incubación
| Días | TA, 30 °C y 40 °C | C obscurus y D conceptione | Total, días de incubación de C. obscurus y D. conceptione | |||||||||
| C obscurus | D. Conceptione | incubado a TA | incubado a 30 °C | incubado a 40 °C | ||||||||
| PH | % A | pH | % A | pH | % A | pH | % A | pH | %A | pH | %A | |
| 3 | 4,41 a | 1,25 b | 4,46 a | 1,50 c | 4,46 a | 1,31 c | 4,45 a | 1,40 b | 4,39 ab | 1,42 a | 4,43 a | 1,37 b |
| 5 | 4,36 ab | 1,56 a | 4,32 b | 1,97 b | 4,39 ab | 1,84 b | 4,32 b | 1,70 ab | 4,30 bc | 1,76 a | 4,34 b | 1,77 a |
| 10 | 4,28 b | 1,66 a | 4,17 c | 2,23 ab | 4,29 b | 2,15 ab | 4,15 c | 2,05 a | 4,23 c | 1,63 a | 4,22 c | 1,95 a |
| 15 | 4,39 ab | 1,59 a | 4,32 b | 2,35 a | 4,32 ab | 2,27 a | 4,33 b | 2,10 a | 4,42 a | 1,54 a | 4,36 ab | 1,97 a |
| 30 | 4,34 ab | 1,63 a | 4,42 ab | 2,07 ab | 4,37 ab | 2,05 ab | 4,28 b | 2,08 a | 4,49 a | 1,41 a | 4,38 ab | 1,85 a |
Días de incubación (s= 0,099 y 0,360; R-cuadrado 33,95% y 27,29%; R- cuadrado ajustado 31,65% y 24,76%).
La misma estabilidad observada al utilizar cualquier de los dos tipos de residuo observación (pH 4,26 y 4,17 también % A de 1,7 y 2,39), donde el residuo de D. Conceptione fue el más estable. Durante el proceso de incubación a TA y a 40 °C el pH no presenta diferencia entre sí, pero si a 30°C, (valores de estabilidad de pH 4,21 y % A 2,07), semejante a los reportado a los 29 °C de incubación por (Castillo-Mercado et al., 2020), durante la incubación los valores de pH y % A en el día 10, 15 y 30 fueron estadísticamente semejantes; la incubación a 40 °C presentó disminución del pH y aumento del % A, entendiéndose que durante la hidrólisis proteica se acelera, produce compuestos nitrogenados de bajo peso molecular, los cuales perturban la capacidad amortiguadora del ensilado al incrementarse los valores de pH y donde las bacterias ácido-lácticas comiencen a producir ácido y reducir el pH obtenido y aumentar la acidez (Barriga-Sánchez et al., 2019) en los procesos de fermentación la temperatura también modifica algunos componentes proteicos de la materia prima como en el caso delos hidrolizados (Renaldi et al., 2022). En todos los procesos de incubación variando la materia prima y temperatura se obtiene pH menor y % A mayor a temperaturas entre 31°C y 32 °C.
Durante el proceso de incubación el pH presenta influencia de interacción de temperaturas con días de incubación. En él % A presenta influencia según días de incubación, materia prima, interacción entre día y la interacción de las tres variables. Se puede considerar según este análisis que la viabilidad según el menor pH y % de A se puede obtener a los 30 días de incubación y con una temperatura de 28 °C valores semejantes a los obtenidos por (Barriga-Sánchez et al., 2019) y que resultan contradictorio al ensilado químico a diferentes temperaturas el cual no cambia el pH a partir de los 48 días de evaluación (Espe & Lied, 1999).
Evaluación microbiológica del ensilado
Se colectaron 150 g de muestras de los EB a los 15 y 30 días, de las siguientes temperaturas: TA, T30 °C y T40 °C.
Una buena práctica de elaboración y la inocuidad de los EB obtenidos se pueden determinar mediante el indicador microbiológicos de alimentos fermentados y alimentos balanceados para cerdos según normas Colombia (Fernández-Herrero et al., 2013); los valores de lactobacilos encontrados a los 15 y 30 días de incubación del EB están dentro de los valores encontrados en alimentos para animales enriquecidos con cepas probioticas (Ayala et al., 2018), siendo el límite permisible 10x105 UFC/g para lactobacilos (Fernández-Herrero et al., 2013; Plaza et al., 2016).
En ensilado inoculados con BAL utilizando materia vegetal como materia prima (Okoye et al., 2023), en menor concentración se encontraron los valores de mesófilos aerobios en el EB incubado a TA y en el residuo del (D conceptione) donde se puede considera que la temperatura de incubación afecta estos valores, pero todos están dentro de los límites permitidos de alimentos para cerdos al comparar las temperaturas TA, 30 °C y 40 °C del Tabla 5 (Fernández-Herrero et al., 2013; Plaza et al., 2016), en el recuento de levaduras y hongos de los tratamientos T2 y T3 los valores fueron de 6,9x104 UFC/mL, 9,3x103 UFC/mL, también dentro del límite permisible correspondientes a 10x104 UFC/g (García et al., 2019; Safari et al., 2022). También se evidencio la ausencia de microorganismos patógenos como Salmonella sp. Posiblemente por la condición de acidez del ensilado generada por las BAL (Ozyurt et al., 2020; Shabani et al., 2019). La cepa de fermentación no modificó los valores encontra-dos el proceso del EB a TA (Ghosh et al., 2022).
Tabla 4 Evaluación de la viabilidad según la temperatura del EB, fermentados con dos especies de pescado a diferentes temperaturas de incubación
| °T | Temperatura ambiente, 30 °C y 40 °C | C obscurus y D conceptione | temperatura de incubación de C. obscurus y D. Conceptione | |||||||||
| C obscurus | D. Conceptione | incubado a °T ambiente | incubado a 30 °C | incubado a 40 °C | ||||||||
| pH | % A | pH | % A | pH | % A | pH | % A | pH | %A | pH | %A | |
| 28 | 4,44 a | 1,72 a | 4,27 cd | 2,10 abc | 4,36 a | 1,91 a | 4,36 a | 1,91 ab | ||||
| 29 | 4,34 ab | 1,75 a | 4,34 a | 1,75 a | 4,34 ab | 1,74 ab | ||||||
| 30 | 4,40 ab | 1,28 b | 4,45 a | 1,94 bc | 4,42 a | 2,14 a | 4,45 a | 1,40 b | 4,44 A | 1,77 ab | ||
| 31 | 4.33 ab | 1.61 ab | 4.33 abcd | 2.58 a | 4.33 b | 2.09 a | 4.33 ab | 2.09 a | ||||
| 32 | 4.26 b | 1.74 a | 4.17 d | 2.39 ab | 4.21 c | 2.07 a | 4.21 b | 2.07 a | ||||
| 33 | 4.36 ab | 1.35 ab | 4.25 bcd | 1.87 bc | 4,27 bc | 1,77 ab | 4,27 ab | 1,77 ab | ||||
| 33,7 | 4,39 ab | 1,53 ab | 4,39 abc | 1,53 ab | 4,39 ab | 1,53 ab | ||||||
| 34 | 4,41 ab | 1,62 ab | 4,41 ab | 1,62 ab | 4,41 ab | 1,62 ab | ||||||
| 40 | 4,30 ab | 1,28 b | 4,48 ab | 1,62 c | 4,40 a | 1,47 a | 4,40 a | 1,47 b | ||||
| 40,7 | 4,44 abcd | 1,85 abc | 4,44 a | 1,85 a | 4,44 a | 1,85 ab | ||||||
| 41 | 4,33 ab | 1,37 b | 4,38 abc | 1,96 abc | 4,35 a | 1,62 a | 4,35 a | 1,62 ab | ||||
| 42 | 4,38 ab | 1,26 b | 4,35 abc | 1,79 c | 4,36 a | 1,52 a | 4,37 a | 1,52 b | ||||
| total | 4,36 ab | 1,54 b | 4,33 a | 2,02 a | 4,37 a | 1,92 a | 4,31 a | 1,86 a | 4,37 a | 1,55 b | ||
Temperatura de incubación (s= 0,106 y 0,379; R-cuadrado 29,10% y 24,11%; R- cuadrado ajustado 21,88% y 16,38%),
Tabla 5 Evaluación microbiológica del EB a los 15 días de incubación
| Parámetro microbiológico | Tiempo evaluación (días) | Cepa 1 | Cepa 2 | ||||||
| D. conceptione TA | D. conceptione 30 °C | D. conceptione 40 °C | C. obscurus TA | C. obscurus 30 °C | C. obscurus 40 °C | C. conceptione TA | C. obscurus TA | ||
| BAL (UFC/ml) | 15 | 10,7x104 | 3,5x104 | 25,7x103 | 5,2x107 | 6,6x107 | 8,5x105 | ||
| 30 | 13,9x106 | 11,5x104 | 10,2x104 | 19,8x105 | 12,8x105 | 8,1x105 | 1,2x105 | 3,2x105 | |
| Mesófilos aerobios (UFC/ml) | 15 | 9,6x104 | 22,5x103 | 5,1x103 | 6,2x107 | 7,4x107 | 6,3x105 | ||
| 30 | 6,9x105 | 9,7x104 | 20,3x107 | 14,4x108 | 6,9x105 | 5,0x105 | 3,9x104 | 1,54x105 | |
| Levaduras y hongos (UFC/ml) | 15 | 19,3x104 | 6,9x104 | 9,3x103 | 26,6x104 | 6,6x105 | 4,7x105 | ||
| 30 | 12,6x105 | 12,3x104 | 6,2x104 | 18,1x107 | 7,4x105 | 4,8x105 | 0,11x104 | 2,08x105 | |
| Salmonella sp. (/25 g) | 15 | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia |
| 30 | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | Ausencia | |
Análisis organolépticos
Las características organolépticas fueron semejantes en todas las variantes en estudio utilizando diferentes BAL, diferentes residuos de pescados, en el día 3 y 5 fue Beige, el día 10 Beige oscuro y los días 15 y 30 marrón a marrón oscuro; para el olor en el día 3 dulce y a pescado, día 5 dulce ácido con suave olor a pescado y los días 10, 15 y 30 ácido suave, ácido fuerte y ligeramente ácido dulce-alcohol y para la consistencia en el día 3 pastoso con poco líquido, el día 5 pastoso, el día 10, 15 y 30 semisólido pastoso semejante a los reportados por diferentes autores (Castillo et al., 2019; Fernández-Herrero et al., 2013; Ghosh et al., 2022), en el estudio se observaron las características de buena calidad del EB semejante a las obtenidas por otros autores, como son color amarronado grisáceo claro, consistencia líquida y olor ácido suave, olor ligeramente a frutas fermentadas, su prolongado tiempo de almacenamiento, hace al ensilado más liviano en consistencia y desarrolla un agradable olor (Barriga-Sánchez et al., 2019; Gaviria et al., 2021; Ghosh et al., 2022; Sánchez Suarez et al., 2016).
Análisis nutricional
En todos los tratamientos según la temperatura de incubación y residuo del Tabla 6, se observa la comparación del contenido de proteína antes del proceso y la proteína después de la fermentación, la cual está en relación directa con la compasión proteica de la materia prima, por lo que se puede considerar que el contenido nutricional del EB depende de la materia prima a utilizada (Espe & Lied, 1999; Fernández Herrero et al., 2017), el proceso del EB no afecta el contenido de proteínas comparando entre residuos de pescado crudo y obtenido en el ensilado biológico (Calderón-Quispe et al., 2017), el EB conservan su valor(Guimarães et al., 2021). Estudios realizados por Zapata et al. (2015) son diferentes en menor cantidad en los encontrados en el ensilado de pescado, obtuvieron resultados en base seca un 26,3% de proteína y 2,9 % de grasa, difieren mucho con los resultados obtenidos con ligero incremento del contenido de en la materia prima inicial (Palkar, 2018; Ziyaei & Hosseini, 2021), son mayores a 28% en dieta para tambaqui (Costa et al., 2024), la cantidad de proteína se ajusta a los requerimientos nutricionales y energéticos necesarios en la alimentación animal, pudiendo ser utilizado, como insumos proteicos de origen animal. El contenido de cenizas es variable dependiendo de los residuos aprovechados (enteros, vísceras, espinas y esqueletos), que tienen un alto porcentaje de cenizas con rangos de 9 a 17%, menores a los obtenidos en el presente trabajo de investigación 26,12%; EB de D conceptione y 29,35% en el C obscurus (Castillo et al., 2019; Fernández, 2021; García et al., 2020; Shabani et al., 2019), en ensilados con pescado entero como materia prima y en base seca (87,5%) mejoran notablemente el contenido de proteína del EB, (62,4%) según (Plaza et al., 2016). La materia prima si alteró la composición proteica del producto final f(Fernández Herrero et al., 2017; Ghosh et al., 2022; Guimarães et al., 2021).
Tabla 6 Composición proximal del EB, según materia prima y temperatura de incubación
| Especie | Tratamiento | MS (%) | G (%) | P (%) | C (%) | FN (%) |
| D. conceptione | Inicial TA (CG) | 90,46 | 10,75 | 32,43 | 24,23 | 1,60 |
| Final TA (CG) | 93,69 | 9,50 | 36,70 | 25,50 | 1,30 | |
| Inicial TA (CC) | 90,46 | 10,75 | 32,43 | 24,23 | 1,60 | |
| Final TA (CC) | 93,69 | 9,50 | 36,70 | 25,50 | 1,30 | |
| Inicial 30 °C | 95,75 | 11,54 | 30,20 | 25,48 | 1,40 | |
| Final 30 °C | 95,78 | 14,00 | 33,80 | 26,12 | 1,70 | |
| Inicial 40 °C | 94,14 | 10,07 | 34,63 | 25,50 | 1,47 | |
| Final 40 °C | 90,37 | 9,76 | 36,00 | 25,50 | 1,50 | |
| C. obscurus | Inicial (CG) | 94,14 | 14,14 | 24,66 | 18,76 | 1,35 |
| Final (CG) | 90,48 | 11,24 | 33,00 | 26,12 | 1,50 | |
| Inicial (CC) | 94,14 | 14,14 | 24,66 | 18,76 | 1,35 | |
| Final (CC) | 90,48 | 11,24 | 33,00 | 26,12 | 1,50 | |
| inicial 30 °C | 92,80 | 13,61 | 27,25 | 25,93 | 1,65 | |
| final 30 °C | 89,66 | 10,07 | 32,60 | 25,50 | 1,23 | |
| inicial 40 °C | 93,30 | 11,19 | 30,60 | 29,35 | 1,54 | |
| final 40 °C | 92,90 | 11,19 | 33,16 | 29,35 | 1,39 |
MS: Materia seca, PC: proteína cruda, G: Grasa, C: Ceniza, FC: Fibra cruda.
CONCLUSIONES
El ensilado biológico (EB), es una alternativa de conservación estable y a la vez mejorar nutritivamente los desechos orgánicos para ser destinados a la alimentación animal (cerdos y aves). En el proceso de fermentación la temperatura influye, en el tiempo de incubación considerándose más eficiente incubar a temperatura de 30 °C, pero si aumenta la incubación a 40 °C se acelera el proceso de incubación, el proceso está estable en menos tiempo de incubación y su deterioro empieza más temprano. En la producción del EB se puede usar indistintamente los diferentes tipos de cepas de bacterias acido lácticas (BAL) nativas, aisladas del tracto digestivo del cerdos y aves evaluadas previamente, por lo que estos hallazgos permitirán considerar como organismos fermentadores para obtener el EB, bacterias nativas aisladas del animal cerdo o gallina. Al aumentar la temperatura de incubación, genera un costo adicional que es parte de la producción del EB. El contenido nutricional del EB depende de la Materia prima utilizada y en proceso el EB aumenta ligeramente el contenido de proteína de la materia prima utilizada. Otra variable que se puede considerar para ser una alternativa procesada mediante el EB pueden ser la mezcla de residuos orgánicos de origen animal y vegetal como materia prima para hacer EB.
